第04章紫外-可见分光光度计

第四章 紫外,-,可见分光光度计,学习要求,掌握：,紫外,-,可见分光光度计工作原理、基本,类型及其特点,紫外,-,可见分光光度计的基本结构及各,部件的基本功能,熟悉：,紫外,-,可见分光光度计的性能指标,、,常,见故障及排除方法,了解：紫外,-,可见分光光度计准确性的影响因,素和应用,内 容 提 要,紫外,-,可见分光光度计的工作原理和基本结构,紫外,-,可见分光光度计的分类,紫外,-,可见分光光度计的性能指标,及准确性影响因素,紫外,-,可见分光光度计的常见故障及排除方法,紫外,-,可见分光光度计的应用,分光光度计,：,指能够从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器。根据其使用光的波长范围不同，分光光度计又可分为紫外分光光度计、可见光分光光度计、红外分光光度计和全波段分光光度计。,现代常用的分光光度计通常将紫外分光光度计和可见光分光光度计合并在一起，称为紫外,-,可见分光光度计,第一节 紫外,-,可见分光光度计,的工作原理和基本结构,吸收光谱（,absorption spectrum,）,：,不同的物质会吸收不同波长的光。改变入射光的波长，并依次记录物质对不同波长光的吸收程度，就得到该物质的吸收光谱。,第一节 紫外,-,可见分光光度计,的工作原理和基本结构,一、紫外,-,可见分光光度计的工作原理,每一种物质都有其特定的吸收光谱，因,此可根据物质的吸收光谱来分析物质的构、,含量和纯度，这就是吸收光谱分析法的理论,基础。,光的吸收定律（朗伯,-,比尔定律）,：当用一束单色光照射吸收溶液时，其吸光度与液层厚度,b,及溶液浓度,c,的乘积成正比。,一、紫外,-,可见分光光度计的工作原理,朗伯,-,比尔定律：,I,0,：,入射光强度,b:,液层厚度,T:,透光度,k:,吸光系数,C:,溶液浓度,I:,透射光强度,A:,吸光度,一、紫外,-,可见分光光度计的工作原理,朗伯,-,比尔定律适用的条件是：,入射光为单色光。波长范围越大，单色光纯度越低，对朗伯,-,比耳定律的偏离就越大。,溶液浓度不能过大。在一定浓度范围内的溶液中，邻近分子的存在并不改变每一给定分子的特性，即分子间互不干扰。当溶液浓度很大时，由于溶液分子的相互干扰，该定律不再成立。,二、紫外,-,可见分光光度计的基本结构,光源,单色器,吸收池,检测器,显示系统,二、紫外,-,可见分光光度计的基本结构,光源（,light source,）：,提供入射光的装置。,不同类型的分光光度计根据需要配有不,同的光源，但对光源有两个基本要求：,1.,在所需波长范围的光谱区域内发射连续光谱；,2.,有足够的辐射强度并能长时间稳定。,二、紫外,-,可见分光光度计的基本结构,几种常用光源比较,光源,波长范围,(nm),特 点,钨灯,330,2500,钨丝易蒸发，寿命短。主要用于可见光区,卤钨灯,330,2500,加入卤素使用寿命延长，稳定性好,氢灯,150,400,用于紫外区,氘灯,150,400,发光强度比氢灯高,3,5,倍,汞灯,254,734,用于紫外或荧光分析仪,二、紫外,-,可见分光光度计的基本结构,单色器（,monochromator,）,：,是将来自光源的,复合光分解为单色光并分离出所需波段光束的,装置，是分光光度计的关键部件。,主要包括：,入射狭缝,色散元件，包括棱镜和光栅,准直镜,出射狭缝组成。,二、紫外,-,可见分光光度计的基本结构,吸收池（,absorption cell,）,：,又称为比色皿、比色杯、样品池或液槽等，是用来盛放被测溶液的器件。同时也决定着透光液层厚度、特定波长光的透光度等多种参数，应具有良好的透光性和较强的耐腐蚀性。可见光范围内：用无色光学玻璃或塑料制作；紫外光范围内：需用能透紫外线的石英玻璃或蓝宝石制作。,二、紫外,-,可见分光光度计的基本结构,检测器：,把光信号转换为电信号的装置称为检,测器，又称为光电转换器。,常用的检测器有：,光电管,光电倍增管,光电二极管阵列,二、紫外,-,可见分光光度计的基本结构,信号显示系统：,是把放大的信号以适当的方式,显示或记录下来的装置。,常用的信号显示装置有：,指针显示,LD,数字显示,VGA,屏幕显示,计算机显示,第二节 紫外,-,可见分光光度计的分类,按其光学系统分可分为,单波长分光光度计：,单光束单波长分光光度计,双光束单波长分光光度计,双波长分光光度计,单光束分光光度计特点,单光束光路，从光源到试样至接收器只有一个光通道，使用中依次对参考样品和待测试样进行测定；,只有一个色散元件，工作波长范围较窄；,通常采用直接接收放大显示的简单电子系统，用电表或数字显示；,结构简单、附件少、功能范围小，不能做特殊试样测定。,单光束分光光度计结构示意图,光源,单色器,吸收池,检测器,显示系统,双光束分光光度计特点,从光源到检测器有试样光路和参考光路两条通路，可同时对检测样品和参考样品进行测定，直接获得检测数据；,一般采用两个光栅或棱镜加光栅的双单色器，能有效地提高分辨率和降低杂散光；,可装备各种附件，光、电、机紧密结合，功能范围较宽；,大大简化测定程序，可以进行波长自动扫描。,双光束分光光度计结构示意图,比值,光源,单色器,吸收池,检测器,显示系统,光束分裂器,双波长分光光度计特点,从同一光源发出的光分为两束，分别经两个单色器分光后得到两束不同波长（,1,，,2,）的单色光，经切光器使两束光以一定频率交替照射同一样品，然后经过检测器显示出两个波长下的吸光度差值（,A=A,1,-A,2,）；,双波长分光光度计不用参比溶液，只用一个待测溶液，能较好的解决由于非特征吸收信号影响而带来的误差，大大提高检测的准确度。,双波长分光光度计结构示意图,第三节 紫外,-,可见分光光度计的 性能指标及准确性影响因素,一、性能指标,(,一,),波长准确度和波长重复性,(,二,),光度准确度,(,三,),光度线性范围,(,四,),分辨率,(,五,),光谱带宽,(,六,),杂散光,(,七,),基线稳定度,(,八,),基线平直度,(,一,),波长准确度和波长重复性,波长准确度也叫波长精度，是指仪器,波长指示器上所指示的波长值与仪器实际输,出的波长值之间的符合程度。,波长重复性是指在对同一个吸收带或,发射线进行多次测量时，峰值波长测量结果,的一致程度。,一、,紫外,-,可见分光光度计的性能指标,(,二,),光度准确度,是指仪器在吸收峰上读出的透射率或吸,光度与已知真实透射率或吸光度之间的偏差。,该偏差越小，光度准确度越高。,(,三,),光度线性范围,是指仪器光度测量系统对于照射到接收,器上的辐射功率与系统的测定值之间符合线,性关系的功率范围，即仪器的最佳工作范围。,一、,紫外,-,可见分光光度计的性能指标,(,四,),分辨率,分光光度计的分辨率是指仪器对于紧密,相邻的峰可分辨的最小波长间隔，反映仪器,分辨吸收光谱微细结构的能力，是衡量仪器,性能的综合指标。,(,五,),光谱带宽,是指从单色器射出的单色光最大强度的,1/2,处的谱带宽度。,一、,紫外,-,可见分光光度计的性能指标,(,六,),杂散光,除所需波长单色光以外其余所有的光都,是杂散光，杂散光是测量过程中的主要误差,来源，会严重影响检测准确度。,(,七,),基线稳定度,基线稳定度是指在不放置样品的情况,下，扫描,100%,T,或,0%,T,时读数偏离的程度。,(,八,),基线平直度,是指在不放置样品的情况下，扫描,100%,T,或,0%,T,时基线倾斜或弯曲的程度。,一、,紫外,-,可见分光光度计的性能指标,二,、,影响因素,（一）单色光不纯的影响,（二）杂散光的影响,（三）吸收池的影响,（四）电压、检测器负高压波动的影响,（五）仪器狭缝宽度的影响,（六）背景吸收的影响,（七）其它因素的影响,二、,影响紫外,-,可见分光光度计准确性的因素,第四节 紫外,-,可见分光光度计的 常见故障及排除方法,故障现象,故障原因,排除方法,接通电源后，指示灯不亮，,仪器不工作,电源线接触不良，,保险丝坏，电路故障,接好电源线，检查保险丝，,更换新的保险丝,不能调零（即,0,T,）,光门不能完全关闭,微电流放大器损坏,检修光门盖，更换放大器,不能置,100,T,光能量不够，光源损坏,比色器架没安装到位，,光门未完全打开,变换灵敏度开关，调整光源,更换新的光源,检查比色器架子，摆正位置,检修光门,测光精度不准,波长移位，吸收池受污染,样品混浊，配制溶液不准确,进行波长校正，清洗吸收池,重新配制溶液,噪声指标异常,预热时间不够，光源老化,环境振动过大，空气流速过,大，样品室不正，电压低,需预热,20,分钟以上，更换光,源，调换仪器运行环境。对,正样品室。加稳压器,第五节 紫外,-,可见分光光度计的应用,一、,基本分析方法,（一）定性分析,（二）定量分析,（三）纯度鉴定,二、,应用实例,（一）可见光谱分析,血清葡萄糖测定,（氧化酶法）,（二）紫外光谱分析,血清丙氨酸氨基转,移酶测定（紫外,-,乳酸脱氢酶法）,再见！,