医学课件MTT法检测细胞活力

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,MTT,法目的和意义,检测细胞存活和生长情况,用于评价药物产生的细胞毒作用,原理,四唑盐（噻唑蓝）是一种能接受氢原子的染料，简称,MTT,活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的,MTT,还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（,DMSO,）能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪在,490nm,波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量，从而反映细胞的增殖情况。,在一定细胞数范围内，,MTT,结晶物形成的量与活细胞数成正比。,活细胞,+MTT,琥珀酸脱,氢酶,紫蓝色结晶物 Formazan,贴壁细胞操作步骤,1.,接种细胞：用,0.25%,胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含血清的培养液配成,单个细胞悬液,，以每孔,2000-3000,个细胞接种于,96,孔培养板中，每孔体积,90 ul,。（边缘孔用,PBS,或空白培养基填充）。,2.,培养细胞：将培养板移入,CO,2,孵箱中，在,37,、,5%CO,2,及饱和湿度条件下培养，至细胞单层铺满孔底（,96,孔平底板，大约,12h,），加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，每孔加药,10 ul,，一般设,5,个复孔。,3.5%CO,2,，,37,孵育分别孵育,24,小时后，倒置显微镜下观察。,4.,每孔加入,10ul MTT,溶液（,5mg/ml,，即,0.5%MTT,），继续培养,4h,。若药物与,MTT,能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用,PBS,冲,2-3,遍后，再加入含,MTT,的培养液。,5.,终止培养，小心吸去孔内培养液。,6.,每孔加入,100ul,二甲基亚砜（置摇床上低速振荡,10min,，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪,OD490nm,处测量各孔的吸光值。,7.,同时设置调零孔（培养基、,MTT,、二甲基亚砜），对照孔（细胞、培养液、,MTT,、二甲基亚砜）,悬浮细胞操作步骤,：,1,）将细胞离心收集后，调节细胞悬液浓度大约,110,4,/ml,，每孔先加细胞悬液,90ul,相应梯度的药物每孔,10ul,；共,100ul,加入到,96,孔板（边缘孔用,PBS,填充）。每板设对照。同时设置调零孔（培养基、,MTT,、二甲基亚砜），对照孔（细胞、培养液、,MTT,、二甲基亚砜），,每组设,5,个,复孔。,2,）置,37,，,5%CO2,孵育,24,小时，倒置显微镜下观察。,3,）每孔加入,10 ul MTT,溶液（,5 mg/ml,，即,0.5%MTT,），继续培养,4 h,4,）,每孔加三联裂解液（,10gSDS,，,异丁醇,5ml,，,10M HCl 0.1ml,用双蒸水溶解配成,100ml,）过夜，第二天早晨置摇床上低速振荡,10 min,，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪,OD570nm,测量各孔的吸光值。,药物的配制,浓度,体积,过滤,MTT,的配制,MTT,一般最好现用现配，过滤后,4,C,避光保存两周内有效，或配制成,5mg/ml,保存在,-20,度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。尤其当,MTT,变为灰绿色时就绝对不能再用了。,MTT,有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套,.,配成的,MTT,需要无菌，,MTT,对菌很敏感；往,96,孔板加时不避光也没有关系，因为时间较短。,实验结果统计学处理,所有数值以,xs,表示，应用,SPSS,软件进行方差分析，,p0.05,时为相差显著，,p0.01,时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线曲线，专门公式求,IC50,（半数抑制浓度）。或计算抑制率。,OD,对照组,-OD,实验组,抑制率,%=,OD,对照组,100%,实验结果统计学处理,公式如下：,lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg,最大剂量,I:lg(,最大剂量,/,相临剂量,),P:,阳性反应率之和,Pm:,最大阳性反应率,Pn:,最小阳性反应率,举例,药物浓度,0.1,、,0.01,、,0.001,、,0.0001,、,0.00001,、,0.000001umol/l,，稀释倍数为,10,，最大浓度为,0.1,，抑制率为,0.95,、,0.80,、,0.65,、,0.43,、,0.21,，,0.06,。代入计算公式：,Pm=0.95,Pn=0.06,P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1,Xm=lg0.1=-1,lgI=lg0.1/0.01=1,lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025,IC50=0.00025,注意事项,1,选择适当的细胞接种浓度。,在进行,MTT,试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。,2,设空白对照，,与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。,实验前应明确的问题,1.,选择适当的细胞接种浓度。,一般情况下，,96,孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有,10,5,个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行,MTT,试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证,MTT,结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。,2.,药物浓度的设定。,一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。,3.,时间点的设定。,在不同时间点的测定,OD,值，输入,excel,表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。,4.,培养时间。,100ul,的培养液对于,10,的,4,5,次方的增殖期细胞来说，很难维持,68h,，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向,G0,期而趋于静止，影响结果，我们是在,48h,换液的。,5.MTT,法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。,做,MTT,时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致,MTT,比色,OD,值的升高。,7.,实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。,调零孔加培养基、,MTT,、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、,MTT,、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。,8.,避免血清干扰。,用含,15,胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于,10,胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。,关于细胞的接种,(,铺板,),细胞过了,30,代以后就不要用了,;,培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。,接种时最好按照预实验摸索出的密度接种,且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而,MTT,细胞密度多采用,10000/ml,，,100ul/,孔。,细胞密度要根据不同细胞的特点来定。,悬浮细胞每孔的细胞数可达到,10,5,贴壁细胞可为,10,3,-10,4,。,MTT,本身就是比较粗的实验，增殖率,10%,左右的波动都不算奇怪。特别是新手，,20,的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是,种板技术一定要过关,。,注意,细胞悬液一定要混匀,，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练鞋、快些上板。,如何清除上清,直接吸出：,加,DMSO,前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，可在这之前先用平板离心机离心,96,孔板，,2000r,，,5,分钟，然后吸掉上清,(,如果是悬浮细胞，则推荐此法,悬浮细胞要离心,2500rpm,10min.,且其做,MTT,最好用圆底型,96,孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉,建议各孔吸弃,150-160ul,即可,),。,翻转倒扣法：,可以直接将板翻转倒扣（垫几层滤纸）,2,3,次，比用“吸”的办法更不容易使细胞脱离出来。可以轻拍，或者倾斜一点帮助吸液，但前提是细胞贴壁要比较牢。,加入,DMSO,在同一批实验中最好不要更换,DMSO,。,加,DMSO,前把孔中液体尽量弃干净如果培养液没弃干净，空白孔也要留有等量的培养液，这样在检测时可以尽量去除培养液的影响，,DMSO,的量也可为,100ul,或,150ul.,加了,DMSO,后用振荡器轻轻振荡,5,10min,时间控制尽量严格一点,放置时间长了会影响结果,值会偏大,且结果不可信,.,加入,DMSO,溶解后尽快检测。,OD,值的测定,至于测定波长的选择是因显色溶液而异的。对于,DMSO,，溶解后呈紫（红）色，,490nm,有最大吸收值。,DMSO,溶后,10,分钟内测，越放颜色越深，而做为溶解液测吸收光值，其值可在三天内保持不变。,细胞密度,偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，,细胞状态不好的话,，吸光度值也会低的；细胞数目少，或者是培养的时间短，,OD,值也会偏低。如果各个孔的孔间差异性特别明显的话说明有可能存在污染,空白孔的,OD,值太高，很可能是,细菌污染,。,谢谢观看,