EPO糖基化类型及作用

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,EPO,糖基化类型及作用,韩云波 王佳彬,70k,生命基地,沈阳药科大学,主要内容,（一）,EPO,的简介,（二）,N-,糖基化,（三）唾液酸对活性的影响,（四）新型,EPO,（一）,EPO,简介,3,人类,EPO,含有,166,个氨基酸,相对分子质量为,34 400,有,4,个糖基化位点,其中,3,个,N-,糖基化位点,(Asn24,38,83),和,1,个,O-,糖基化位点,(Ser126),并有,2,个二硫键连接。其中,60%,是蛋白质,(,单个多肽链,),40%,为糖类。,糖基化对稳定,EPO,的体内活性具有重要作用,若缺乏糖链,则,EPO,在体内迅速被水解而失活，而在,体外增强,。,r,HuEPO,的一级结构、,Glu,-C,酶解片段,5,EPO,简介,3,天然存在的,EPO,分为两种类型,型含,34%,的碳水化合物,型含,26%,的碳水化合物。两种类型在生物学特性、抗原性及临床应用效果上均相同。,EPO,主要通过促进骨髓中红系祖细胞的存活、增殖和分化以调控红细胞的生成。,EPO,简介,近年来研究显示，仅能进行,N-,连接而不能进行,O-,连接的糖类对,EPO,功能的产生具有重要意义,.,（二）,EPO,的,N-,糖基化,研究表明,EPO,的,N-,糖基化程度对,EPO,的体内活性有相当大的影响。,N-,糖基化不完全的,rhEPO,体外活性正常,而体内活性则降低到体外活性的,1/500,其体内被清除的速率也明显降低,9,。,EPO,属于内源性物质,正常人体液中含量很低,半衰期短。,rhEPO,与内源性,EPO,的氨基酸序列完全相同,仅糖基部分有微小的差别,10,。,rhEPO,比天然,EPO,含有更多的三天线及四天线低聚糖,并且二者在唾液酸化程度上有明显的差别,11,12,。,rhEPO,糖基化性质与,rhEPO,的生物学功能关系密切,且是内源性,EPO,与外源性,EPO,的区别所在。,r,HuEPO,中氮连接寡糖的结构和类型,氮连接寡糖分为,3,种类型,即高甘露糖型、杂种型和复杂型。,rHuEPO,中氮连接寡糖为复杂型寡糖。该类型寡糖在组成上可分为糖核部分、天线部分及末端唾液酸部分。其中糖核部分是固定不变的,而天线部分可为二天线、三天线、四天线,最多只能为四天线,天线的组成为乙酰氨基乳糖,且可增加一个乙酰氨基乳糖单元,末端为唾液酸,唾液酸较易脱落。,EPO,中的四天线寡糖是氮连接寡糖中分子量比较大的。,r,HuEPO,中氮连接寡糖的结构和类型,通过,MALDI/TOF MS,分析各个位点的寡糖肽,表明二天线寡糖主要在,24,位点上,38,和,83,位点主要以多天线为主。,国产,EPO,的寡糖唾液酸乙酰化的程度高,大部分寡糖的唾液酸都被乙酰化了，多天线唾液酸乙酰化有助于,EPO,在体内的抗酶解,降低代谢速率,提高生物活性。,3,个氮连接寡糖位点的微不均一性,利用糖肽中肽段的辅助离子化作用,将唾液酸和寡糖作为一个整体分析。将国产,rHuEPO,用,Glu,-C,酶解,HPLC,分离,ESI,MS,在线监测含糖位点,并用在线,ESI,MS,分析,83,和,38,位点氮连接寡糖的微不均一性,MALDI/TOF MS,分析了,3,个糖基化位点的寡糖的微不均一性。,（三）唾液酸含量对其体内生物学活性的影响,8,EPO,分子中糖含量与其体内生物学活性相关早,有报道,6,。正常,EPO,分子内唾液酸含量约,10mol/,molEPO,7,。唾液酸存在于糖链的末端,有报道指出,分子中唾液酸含量低的,EPO,分子,糖链末端的裸露,的半乳糖残基容易被肝细胞上的受体所识别,从而,被肝细胞吸收分解,降低了体内的生物半衰期,是其,体内生物学活性低的原因,7,。,唾液酸含量对其体内生物学活性的影响,8,体内生物学活性低的,EPO,的相对分子质量也较体内生物学活性高的,EPO,的低。推测是由于,EPO,分子糖基化不完全,特别是高分枝的糖链结构少,有效唾液酸化的糖链末端少,因而生物学活性低。,还有研究表明：糖链以,4,条分枝为主,(,完全由唾液酸构成,),的,EPO,，其活性相当于“标准”的,EPO,活性，而以,2,条分枝为主,(,完全由唾液酸构成,),的,EPO,，其活性在体外,3,倍多于,“,标准”,EPO,，而在体内则仅为正常活性的,15%,。,糖基化与生物活性关系,4,采用间苯二酚显色法测定,rhEPO,的唾液酸含量,;,网织红细胞法测定,rhEPO,的生物活性,;,并对二者进行相关性分析。,糖基化与生物活性关系,1,唾液酸含量测定 间苯二酚显色法,糖基化与生物活性关系,2,EPO,唾液酸含量与生物活性关系分析,以唾液酸与,rhEPO,蛋白比值为横坐标,以比活性为纵坐标制作曲线,见图,1,糖基化与生物活性关系,糖基化与生物活性关系,本次实验总结,随着唾液酸含量的增加,生物活性随之增加,具有显著正相关性,但增加的幅度无一定的规律,;,当唾液酸,/EPO,值,8.28,时,生物比活性小于,120000IU/mg,。,结论,成熟的重组人红细胞生成素,(,rhEPO,),是由,166,个氨基酸残基组成的高度糖基化蛋白。糖基化的程度对其生物活性有很大的影响。,通过实验,我们认为重组人红细胞生成素唾液酸含量高低与其生物比活性具有显著的相关性,当唾液酸含量低时,则生物活性低,这与国内有关报道相符。,正常,EPO,分子内,唾液酸含量约,10mol/mol EPO,。,糖基化对治疗蛋白性质的影响,1,治疗蛋白革命性地改变了很多疾病的治疗结果,但体内活性低和快速的消除限制了其使用。,糖工程,是最近采用的一项新技术,通过改变与蛋白相连的糖类来改变蛋白质的药代动力学性质。这一技术已运用于促红细胞生成素,研制出一种促红细胞生成素高糖基化类似物,DA(darbepoetinalfa,),它含有,2,个附加的,N-,连接糖类。在血清中的半衰期增加了,3,倍,与重组人红细胞生成素比较,体内活性增加,提高了蛋白质的稳定性、可溶性,并且减少了免疫原性。,（四）新型促红细胞生成素,3,1,长效红细胞生成素,2,EPO,融合蛋白,3,其他促红细胞生成素,1,长效红细胞生成素,新红细胞生成刺激蛋白,(NESP),又称,Darbepoetin,alfa,Aranesp,是美国,Amgen,公司研制的长效,EPO,制剂,于,2001,年,6,月底获得欧洲药物评审委员会批准,用于慢性肾衰,(,chronicrenal,failure,CRF),引起的贫血。,NESP,是一种高糖基化,rhEPO,类似物,(,Hyperglycosylated,rhEPO,analogues),也是第一个被批准用于临床的新型促红细胞生成素,具有,rhEPO,相似的作用机制即刺激红系造血,。,1,长效红细胞生成素,NESP,含,5,个,N-,糖基化位点及比,rhEPO,高,2,倍的唾液酸残基,在一级结构中多了,5,个氨基酸和,N,端另外,2,个糖基化位点,从而达到较大的代谢稳定性和,3,倍于,rhEPO,的半衰期,(36 h,rhEPO,为,4,8 h),可减少给药次数。,NESP,常用剂量为,0.5,2.25g/kg,皮下注射,每周,1,次或隔周,1,次,12,周为,1,疗程。,其副作用与,EPO,相同。迄今为止尚未检测出,NESP,抗体。,期临床研究显示,慢性肾衰贫血病人使用,Aranesp,可使血红蛋白水平增加至,11 g/dl,。,Macdougall,(1999,年,),已应用于,CRF,贫血患者,Kotasek,等,(2000,年,),和,Glespy,等,(2001,年,),已应用于,CRA(,化疗或不用化疗,),患者,均取得了满意疗效,认为,NESP,是一种安全、有效并有应用前景的新的,EPO,制剂。,2,EPO,融合蛋白,法国学者,Dalle,等,于,2001,年利用基因重组技术合成了一种二聚体,EPO,由两个,EPO,及一个,9,肽连接而成的融合蛋白。,实验证明无论由化学交联还是由重组,DNA,介导的编码区融合而获得的两个,EPO,分子的耦联,都能得到比天然单体更稳定,体内寿命更长的蛋白。,2,EPO,融合蛋白,有些研究者试图构建表达,EPO,与其他细胞因子的融合蛋白,如血小板生成素,(,Thrombopoietin,TPO),与,EPO,的融合蛋白,希望能作为肿瘤化疗的辅助治疗药物,同时纠正红细胞贫血和血小板减少症,。,3,其他促红细胞生成素,EPO,模拟肽是,Wrighton,等在,1996,年采用噬菌体表面呈现技术在肽库中筛选出来的,20,肽,其相对分子质量远小于,EPO,的相对分子质量,但其生物功能与,EPO,基本相同,能与,EPO,受体结合,激活后能引起一个与,EPO,本身完全相同的细胞内信号机制,是一个具有潜在应用价值的小活性肽。,3,其他促红细胞生成素,EPO,模拟肽同天然,EPO,比活性仍很低,且相对分子质量很小,直接用于表达有较大困难。,采用特定的限制性内切酶位点来构建串联体,其优点在于可人为地控制串联体的大小。从理论上讲只要不超出一定范围,可构建,4,串联体、,8,串联体、,16,串联体等任意大小的模拟肽多聚体。,参考文献,1.Foreign Medical Sciences Section of Pharmacy,2006 Aug;33(4),2.JOURNALOFTIBETUNIVERSITY 2002 Sept;17(3),3.,ChinJ BiologicalsMarch 2004,Vo1.17 No.2,4,.,广 东 药 学,2003,年第,13,卷第,1,期,5,.,药学学报,Acta,Pharmaceutica,Sinica,2000,35(10):764 769,6,.,Krantz SB,Fitzgerald FE,Chung E,et al.,Erythropoeitin,.Blood,1991,77(3):419,434.,7,.,Sasaki H,Bothner,B,Dell A,et al.Carbohydrate structure of erythropoe2itin expressed in,chinese,hamster ovary cells,byahuman,erythropoeitincDNA,.J,Biol,Chem,1987,262(25):1259,1276.,8,.,ChinJ,Biologicals,1999,Vo1.12.No.4,9,.,W,asley,L C,Timony,G,Murtha P,Stoudem,ire J,Dorner,A J,Caro,J,KriegerM,Kaufman R J.B,lood,1991,77:2624,2632,10,.,L ipp i G,Guidi G.Clin.Chem.Lab.M ed.,2000,38(1):13,19,11,.,Tsuda,E,Goto,M,Murakam,i A,Akai K,Ueda M,KawanishiG,Takahashi,N,Sasaki R,Chiba H,Ishihara H.B ioche2m,istry,1988,27:5646,5654,12,.Berglund B,Ekblom,B.J.,In.t,M ed.,1991,229(2):125,130,Thank You!,