高级生化试验-紫外分光光度法的应用课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,紫外分光光度法的应用,一、物质对光的选择性吸收,物质的颜色,由物质与光的相互作用方式决定。,人眼能感觉到的光称可见光，波长范围是：,400760nm,。,让白光通过棱镜，能色散出红、橙、黄、绿、蓝、紫等各色光。,单色光：,单一波长的光,复合光：,由不同波长的光组合而成的光，如白光。,光的互补：,若两种不同颜色的单色光按一定比例混合得到,白光,，称这两种单色光为,互补色光,，这种现象称为,光的互补,。,物质的颜色：是由于物质对不同波长的光具有,选择性吸收,而产生。,即物质的颜色是它所吸收光的互补色。,无色溶液：透过所有颜色的光,有色溶液：透过光的颜色,黑色：吸收所有颜色的光,白色：反射所有颜色的光,物质的本色,完全吸收,完全透过,吸收黄光,光谱示意,表观现象示意,复合光,蓝光,无色,黑色,物质的颜色与光的关系,基于物质吸收,紫外或可见光,引起分子中价电子跃迁、产生分子,吸收光谱,与物质组分之间的关系建立起来的分析方法，称为,紫外可见分光光度法（,UV-vis,）,。,二、紫外,-,可见分光光度法,（,1,）,灵敏度高，可测到,10,-7,g/ml,。,（,2,）准确度好，相对误差为,1%-5%,，满足微量组分测定要求。,（,3,）选择性好，多种组分共存，无需分离直接测定某物质。,（,4,）操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单、便宜。,（,5,）应用广泛，无机、有机物均可测定。,紫外,-,可见分光光度法的基本原理,一、透光率（透光度）和吸收度,透光率,T,定义：,T,取值为,0.0%100.0%,T=0.0%,：光全吸收,T=100.0%,：光全透过,吸光度（吸收度）,A,T=,I,t,I,0,100%,显然，,T,，溶液吸收度；,T,，溶液吸收度。,即透光率,T,反映溶液对光吸收程度，通常用,1/T,反映吸光度,。,定义：,A=lg,1,T,=-lgT=lg,I,0,I,t,A=-lgT,T=10,-A,t,I,0,=I,t,+I,a,+I,r,吸收光,反射光,透过光,I,a,T,与,A,关系：,I,r,A1/T,，,T=0,，,A=,，,T=100%,，,A=0,二、光的吸收定律,朗伯,(Lambert),和比尔,(Beer),分别于,1760,年和,1852,年研究,吸光度与溶液厚度和其浓度,的,定量关系,：,朗伯定律,：,A=k,1,L,比尔定律,：,A=k,1,C,A=k C L,一束平行,单色光,通过一,均匀、非散射,的吸光物质溶液时，在入射光的,波长、强度以及溶液温度等保持不变时,，该溶液的,吸光度,A,与其浓度,C,及,液层厚度,L,的乘积,成正比,。,入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。,均匀、无散射溶液、固体、气体。,吸光度,A,具有加和性。,A,a+b+c,=A,a,+A,b,+A,c,注意,!,适用范围,朗伯,-,比尔定律,:,L2L,时，,A,、,T,？,2A,A=-lgT,T=10,-A,=10,-kcL,吸光系数,浓度,液层厚度,T,2,三、吸光系数,1,、摩尔吸光系数,或,E,m,：,在一定,下，,c=1mol/L,，,L=1cm,时的吸光度。,单位：,L/(mol.cm),（,1,）一定条件下是一个特征常数。,（,2,）在,温度和波长,等条件一定时，,仅与物质,本身的性质,有关，与,待测物浓度,c,和,液层厚度,L,无关,；,（,3,）,定性和定量分析依据,：同一物质在不同波长时,值不同。,不同物质在同一波长时,值不同。,max,表明了该物质在最大吸收波长,max,处的最大吸光能力。,4,、吸光系数的意义,:,2,、百分吸光系数,/,比吸光系数 ：,3,、两者关系,:,A=k c L,k=A/c L,一定,下,c=1%(W/V),，,L=1cm,时的吸光度。,单位：,100ml/g.cm,1g/100ml,1,定义：以,A,为纵坐标，,为横坐标，,绘制的,A,曲线。,四、吸收光谱,（吸收曲线）,2,吸收光谱术语：,吸收峰,max,吸收谷,min,肩峰,sh,末端吸收,强带：,max,10,4,，弱带：,max,0.01mol/L),会使,C,与,A,关系偏离定律：,粒子相互作用加强，吸光能力改变。,溶液对光的折射率显著改变。,故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液,。,溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。,例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：,CrO,4,2-,2,H,=,Cr,2,O,7,2-,H,2,O,溶液中,CrO,4,2-,、Cr,2,O,7,2-,的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液,pH,对测定有重要影响。,（一）化学因素,朗,比耳定律假定所有的吸光质点之间不发生相互作用；,（二）光学因素,1,非单色光的影响：入射光为单色光是应用该定律的重要前提：,2,杂散光的影响：仪器本身缺陷；光学元件污染造成。,3,反射和散色光的影响：散射和反射使,T,，,A,，吸收光谱变形。通常可用空白对比校正消除。,4,非平行光的影响：使光程，,A,，吸收光谱变形。,0.575,紫外,-,可见分光光度计,依据朗伯,-,比尔定律，测定待测液吸光度,A,的仪器。（,选择不同波长单色光,、浓度,）,光源,单色器,吸收池,检测器,信号处理及显示,分光光度计外观,分光光度原理图,:,一、主要部件,1.,光源：,2.,单色器,：包括狭缝、准直镜、色散元件,钨灯或卤钨灯,氢灯或氘灯,可见光源,3501000nm,紫外光源,200360nm,色散元件,棱镜,光栅,对不同波长的光折射率不同,衍射和干涉,不同波长的投射方向不同,玻璃棱镜,:,适用于可见区,石英棱镜,:,适用于紫外区,高度抛光的玻璃上刻有等宽、等距平行条痕,狭缝：进出光狭缝。,准直镜：复合光平行光色散后聚集狭缝,最佳宽度,:,减小狭缝宽度而溶液吸光度不变。,3.,吸收池,：比色皿、比色杯，装样品溶液。有玻璃、石英杯两种,4.,检测器,：光电，光电池,(,硒,硅,),，光电管,(,红,紫,),，光电倍增管。,5.,信号处理显示器：放大较弱的电信号，并在检流计上显示出来。,比色皿：玻璃,VS,石英杯,适用的波长范围不一样,石英的范围更广,波长最小可以到达,210nm,可以用在紫外光程,一般测核酸和蛋白都用石英比色皿,基本上测什么试剂都可以,但价格高,一般一个都要在几百块人民币,玻璃的局限性大一些,主要用于可见光程,相对便宜 现在市场上塑料比色皿也在流行起来,但主要还是欧美地区使用的最多,特点是价格便宜,不怕摔,可以一次性试用,省时省力,也更安全,也分不同材质,但波长范围仍然还是比石英比色皿小一些,光学玻璃适用透过率：,320nm-2500nm,紫外石英适用透过率：,190nm-2500nm,二、分光光度计类型,单波长,分光光度计,双波长分光光度计,单光束,分光光度计,双光束,分光光度计,可见光区,:,可紫外,-,见光区,:,721,型,751,，,754,型,760,型,仪器简单，单色光误差大,仪器简单，要求光强度稳定高,普遍采用的光路,wfz800-S,日本岛津,UV-300,型,特定情况（背景、共存组分干扰）下使用,各种分光光度计使用,化学教学网,视频操作,第四节 分析条件的选择,一、测量条件的选择,1.,吸光度的范围：,T 20%65%,，,A0.2,0.7,之间,吸收最大的波长为入射光，干扰最小,二、显色反应条件的选择,显色反应：,将试样组分转变成有较强吸收的有色化合物的反应。,显色剂：,与被测组分化合生成有色物质的试剂。,1.,显色反应的条件：,(1),定量反应、选择性要好；干扰少。,(2),灵敏度要高，摩尔吸光系数,大。,(3),有色化合物的组成要恒定，化学性质要稳定。,(4),有色化合物与显色剂的最大吸收波长之差,60nm,。,(5),显色反应的条件要易于控制。,2.,测定波长的选择：,M,十,R,MR,（被测物）（显色剂）（有色配合物）,三、参比溶液（空白溶液）的选择,用于,调节,100%T,，若选择不适当，对测量读数的影响较大。主要是,消除溶液中其他组分对光的吸收等带来的影响,。,1.,溶剂参比液,当,试液、试剂、显色剂,均无色时，用溶剂,(,通常是,蒸馏水,),作参比液；,3.,试剂参比液,如果,显色剂或其他试剂略有吸收,，可用,不含待测组分,的试剂溶液作参比溶液。,2.,试样参比液,如果试样中的,其他组分也有吸收,，但不与显色剂反应，则当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液。,4.,平等操作参比液,用,不含待测组分,的溶液，在相同条件下与待测试样同时进行处理，此为平行操作参比溶液。,定性与定量分析,紫外,-,可见分光光度法主要用于,有机物分析,。,定性分析：比较,吸收光谱特征,可以对纯物质进行,鉴定及杂质检查,；,定量分析：利用,光吸收定律,进行分析,（一）定性鉴别：,一、定性分析,对比法：比较,样品化合物,的吸收光谱特征与,标准化合物,的吸收光谱特征；或与文献所载的化合物的标准谱图进行核对。,同一物质有相同吸收光谱图，反之不一定是同一物质。,咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：标准品；下：样品,2,、对比吸光度（或吸光系数）,相同条件下，同一物质吸光度比值是吸光系数的比值。,（二）纯度检查,1,、杂质检查：有杂质时，吸收光谱变形。,2,、杂质限量检查：以某一波长吸光度值表示；,以峰谷吸光度比值表示。,3,、对比吸收光谱的一致性,将试样与已知标准样品用同一溶剂配制成相同浓度的溶液，在同一条件下分别扫描吸收光谱，核对其一致性。,1,、对比吸收光谱特征数据：,max,、,min,、,sh,不同基团化合物可能有相同的,max,值，但,max,有明显差别；,有相同吸光基团同系物，其,max,、,max,值,接近，但分子量不同，,E,1%,1cm,差别大。,A,1,/A,2,=E,1,/E,2,例,1,：阿司匹林在空气中容易吸收水分产生水杨酸，阿司匹林在,280nm,处有强吸收峰，而水杨酸的吸收峰迁移到,312nm,，只要检测在,312nm,处是否有吸收峰，即可判断有无水杨酸。,例,2,：无水乙醇精制过程中要用苯，测定无水乙醇中是否残留苯，测定其吸收光谱，乙醇在,210 600nm,之间无吸收峰，而苯在,250,、,254 nm,有吸收峰，以纯无水乙醇为参比，对样品进行光谱分析，如果在,250,、,254nm,处出现吸收峰，则说明有苯残留。,例,3,：如药典规定,VB12,的,E,1%,max,，,361nm,，,1cm,=207,，上述,VB12,注射液原标示浓度为,0.05%,，求实际浓度，方法：药液用重蒸水精确稀释,20,倍，水做参比，用,361nm,测定的吸光度为,0.512,，其含量为：,1%207=x%0.512,，,x%=0.00247%,，浓度,=0.00247%20=0.049%,溶剂对紫外光谱的影响,在测定有机物的紫外可见吸收光谱时，在溶解度容许范围内，应尽量选择非极性溶剂或极性较小的溶剂（烷、烯烃，如正己烷、正庚烷），以获得吸收光谱的精细结构。,与标准样品或标准图谱进行对比时，必须用相同的溶剂。所选择的溶剂在所研究的光谱区域内应该没有明显的吸收；并且不含有其它干扰物质；与溶质没有相互作用。否则会使光谱线产生移动，低于此波长时，溶剂的吸收不可忽略。,常用溶剂的波长范围如下：,.,溶剂 使用波长范围 溶剂 使用波长范围,甲醇,210,二氯甲烷,235 .,乙醇,215,氯仿,245,.,水,210,乙酸乙酯,260 .,96%,硫酸,210,苯,280 .,乙醚,215,甲苯,285 .,二、定量分析,分光光度法被广泛的应用在各个领域，环境、医药、石油等测定无机、有机微量成份。由于操作简单，仪器廉价，一般说是常用的首选方法。,（一）单组分的定量分析,1,、标准曲线（工作曲线）法：,配制一系列不同浓度的标准溶液，在同一条件下分别测定吸光度，然后以吸光度,A,为纵坐