动物组织中核酸的提取与鉴定9

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,动物组织中核酸的提取与鉴定,内蒙古农业大学,生物化学与分子生物学实验教学中心,制作人：王瑞刚,实验原理,实验试剂,实验步骤,实验原理,动物组织细胞中的核糖核酸,(,RNA),与脱氧核糖核酸,(,DNA),大部分与蛋白质结合形成核蛋白。可用三氯醋酸沉淀出核蛋白，并用,95%,乙醇加热除去附着在沉淀上的脂类,杂质。然后用,10%,氯化钠从核蛋白中分离出核酸,(,钠盐形,式,),，此核酸钠盐，加入乙醇可以被沉淀析出。,析出的核酸,(,DNA,与,RNA),均由单核苷酸组成，在单核苷酸中含有磷酸、有机碱,(,嘌呤与嘧啶,),或戊糖,(,核糖、脱氧核糖,),。核酸用硫酸水解后，即可游离出这三类物质。用下述方法可分别鉴定出这三类物质：,1,磷酸：用钼酸铵与之作用可生成磷钼酸，磷钼酸可被氨,基奈酚磺酸还原形成蓝色钼蓝。,2,嘌呤碱：用硝酸银与之反应生成灰褐色的絮状嘌呤银化,合物。,3,戊糖,(1),核糖：用硫酸使之生成糠醛，糠醛与,3,5-,二羟甲苯缩合,而成为一绿色化合物：,(2),脱氧核糖在硫酸作用下生成,-,羟基,-,-,酮基戊糖，后,者与二苯胺作用生成蓝色化合物：,实验试剂,1,钼酸铵试剂：钼酸铵,2.5,g,溶于,20,mI,蒸馏水中，再加入,5,mol/L,硫酸,30,ml,，,用蒸馏水稀释,1,OOml,。,2,氨基奈酚磺酸：商品氨基奈酚磺酸,(1,，,2,，,4-,Amino-,naphthol,Sulfonic,Acid),为暗灰色。用下法提纯后使用,:,在,100,ml,蒸馏水中,(90),溶解,15,g,亚硫酸氢钠及,1,g,亚硫酸钠，,加入,1.5,g,商品氨基奈酚磺酸，搅拌使大部分溶解,(,仅,少量杂质不溶解,),，趁热过滤，再迅速使滤液冷却。,加入,lml,浓盐酸，则有白色氨基奈酚磺酸沉淀析出。,过滤并洗涤固体数次。再用乙醇洗涤直到纯白色为,止。最后用乙醚洗涤，并将固体放在暗处，使乙醚挥,发。将此提纯的氨基奈酚磺酸保存于棕色瓶中备用。,氨基奈酚磺酸溶液配制：取,195,ml,的,15%,亚硫酸氢钠溶液,(,溶液必须透,明,),加入,0.5,g,提纯的氨基奈酚磺酸及,20%,亚硫酸钠溶液,5,ml,。,并在热水,浴中搅拌使固体溶解,(,如不能全部溶解，可再加,20%,亚硫酸钠溶液，每,次数滴，但加入量以,lml,为限度,),。此为浓溶液。置冰箱可保存,2-3,周，如颜色变黄时，须重新配制。临用前，将上述浓溶液以蒸馏水稀释,10,倍。,3,、,3,，,5-,二羟甲苯溶液取密度,1.19,的盐酸,100,ml,，,加入六水氯化铁,100,mg,及二羟甲苯,100,mg,，,混匀溶解后，置于棕色瓶中。此试剂宜,在临用前新配制。市售的,3,，,5-,二羟甲苯若不纯必须用苯重结晶一、,二次，并用活性碳脱色方可使用。,4,二苯胺试剂：取,1,g,纯的二苯胺溶于,100,m1,重蒸馏的冰乙酸中,(,或分析,纯冰乙酸,),，加入,2.75,ml,浓硫酸，摇匀。放在棕色瓶中保,存。此试剂需临用时配制。,5,0.9%,Nacl,。,6,20%,三氯醋酸。,7,95%,乙醇。,实验步骤,(,一,),匀浆制备,称取新鲜猪肝,(,或大白鼠肝脏,)5,克，加入等量冰冷的,0.9%,NaCl,溶液（可先放少量，待研磨成匀浆后加入剩余,部分），及时剪碎。放人研钵中加入少量石英砂，研磨成,匀浆。研磨过程中，要随时将研钵置于冰中冷却。（匀浆制备一定要在低温条件下制作，操作要迅速，以避免核酸,分解。）,(,二,),分离提取,1,将匀浆,5,m1,置于离心管内，立即加入,20%,三氯醋酸,5,ml,，,用玻棒搅,匀，静,3,min,后，以,3000,r/min,离心,l0min,。,2,倾去上清液，沉淀中加入,95%,乙醇,5,m1,，,用玻棒搅匀。用一个装,有长玻璃管的木塞塞紧离心管口，在沸水浴中加热至沸，回馏,2,min,。,注意乙醇沸腾后将火关小，以免乙醇蒸气燃烧。冷却后,2500,r/min,离心,l0min,。（,脱脂）,3,倾去上层乙醇。将离心管倒置于滤纸上，使乙醇倒干。沉淀中加入,10%,氯化钠溶液,4,ml,，,置沸水浴中加热,8,min,，,并用玻棒搅拌。取,出待冷却以,2500,r/min,离心,l0min,。,4,将上层清液量取体积后倾人一小烧杯内。若不清亮可重复离心一,次。,5,取等量在冰浴中冷却的,95%,乙醇（在冰箱中），逐滴加入小烧杯,内。即可看见白色沉淀析出。静置,l0min,后，转人离心管,3000/,min,，,离心,10,min,，,即可得核酸的白色钠盐沉淀。,（四）,DNA,与,RNA,成分的鉴定,1,磷酸的鉴定 取试管,2,支，按表操作,管号,水解液,5%,硫酸,钼酸铵试剂,氨基奈酚磺酸,测定,对照,10,滴,10,滴,5,滴,5,滴,20,滴,20,滴,2,嘌呤碱的鉴定,:,取试管,2,艾，按表操作,管号,水解液,5%,硫酸,浓氨水,5%AgNO,3,测定,对照,20,滴,20,滴,数滴使呈碱性,数滴使呈碱性,10,滴,10,滴,3,核糖的鉴定 取试管,2,支，按表操作,将,2,支试管放入沸水浴内加热,10,min,管号,水解液,5%,硫酸,3,，,5,二羟甲苯试剂,测定,对照,4,滴,4,滴,6,滴,6,滴,4,脱氧核糖的测定 取试管,2,支，按表操作,将两管同时放人沸水浴,l0min,管号,水解液,5%,硫酸,二苯胺试剂,测定,对照,20,滴,20,滴,40,滴,40,滴,