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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,传统发酵技术微生物的培养和应用,课时,39,果酒,的制作,果醋,的制作,腐乳,的制作,泡菜,的制作,本节课内容,传统发酵技术,微生物的培养和应用,微生物,培养基的配置,微生物的纯化培养,微生物培养、分离、计数和鉴定,1.1,果酒制作,1.1.1,原理,有氧呼吸,无氧呼吸,酶,C,6,H,12,O,6,+6O,2,6CO,2,+6H,2,O+,能量,C,6,H,12,O,6,2C,2,H,5,OH+2CO,2,+,能 量,酶,酵母菌代谢类型属于异养兼性厌氧型。既能进行有氧呼吸，又能进行无氧呼吸。前期,有氧呼吸,过程中，酵母菌在酸性环境中,大量繁殖，,后期在,无氧条件,下进行,酒精发酵,。其反应方程式如下：,根据上述反应方程式，可通过定性检测发酵过程中产生,CO,2,含量的多少，来判定发酵过程是否完成。,挑选葡萄拣选去梗破皮挤碎酒精发酵葡萄酒,主要控制指标：,1,3,2,对,发酵,温度、时间,、酸碱度,有什么要求？,温度：,1825,时间：,10-12d,pH,值：,4.05.8,发酵之前加,Na,2,SO,3,的作用是什么？,抑菌：,杀死葡萄皮表面的杂菌,抗氧化：,保护酒液的天然水果特性,防止酒液老化,如何判断产生了酒精？酒精度数的检测？,判定：,酸性,重铬酸钾,与酒精反应,，呈,灰绿色,检测：用密度瓶法测试酒精度数,1.1.2,过程,橙红色,灰绿色,重铬酸钾,重铬酸钾与酒精反应,重铬酸钾滴入葡萄酒样品,1.1.3,酒精检测,1.2,果醋制作,最适温度,30,0,C,35,0,C,特 性,好氧细菌,糖分 醋酸,醋酸菌,醋酸菌死亡,乙醇 乙醛 醋酸,当氧气、糖源充足时：,当短时间中断氧气时：,当缺少糖源时：,C,2,H,5,OH+O,2,CH,3,COOH+H,2,O,C,6,H,12,O,6,+2 O,2,2,CH,3,COOH+2CO,2,+2H,2,O,1.2.1,原理,醋酸菌发酵,1.2.2,操作过程,1.对发酵瓶、纱布、榨汁器等用具进行清洗并,消毒,。,2.取葡萄500g，去除枝梗和腐烂的子粒。,3.用清水冲洗葡萄1-2次除去污物。,（注意冲洗次数不宜 太多）,4.榨取葡萄汁后将其装入发酵瓶。,5.将发酵瓶置于适宜的温度下发酵。,6.简易装置2-4天,排气,一次。（拧松瓶盖）,7.10天后，开始进行取样检验工作。,8.在制成的果酒中加入醋酸菌或醋曲，然后移至,30-35,条件下发酵，适时向发酵液中,充气,。,醋酸发酵,果酒,酒精发酵,果醋,挑选葡萄,冲洗,榨汁,发酵瓶,果酒果醋制作流程,酵母菌,醋酸菌,生物类型,需氧情况,适宜温度,酵母菌与醋酸菌的比较,单细胞真菌,细菌,兼性厌氧型,需氧型,18,25,30,35,原理：参与腐乳制作的主要微生物,1.3,腐乳的制作,起主要作用,青霉,曲霉,酵母,毛霉,毛霉是种丝状真菌，属于真核生物，外呈毛状。,常栖生在果实、果酱、蔬菜、糕点、乳制品等食品上，引起食品腐败变质。,1.3.1,毛霉,毛霉等微生物产生,蛋白酶、脂肪酶，,分解有机物。,蛋白质,蛋白酶,氨基酸,+,小分子肽,脂肪,脂肪酶,甘油,+,脂肪酸,1.3.2,实验设计,让豆腐上长出毛霉,加盐腌制,加卤汤装瓶,密封腌制,创造条件，让毛霉生长：,温度保持在,15-18,；豆腐水分控制在,70%,左右。,加盐控制毛霉生长：,逐层加盐，随层数的加高而增加盐量，腌制大约,8,天左右。,增加风味和口感，控制毛霉的生长：,封瓶时瓶口通过酒精灯火焰防止瓶口污染。,控制好材料的各种量,1.,豆腐含水量：70%,.,2.,腌制时注意控制盐的用量,盐的浓度过低不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；浓度过高会影响腐乳的口味。,3.,卤汤中酒的含量应控制在,12%,左右,酒精含量过高将会延长腐乳成熟的时间；含量过低不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败。,1.3.3,注意事项,防止杂菌污染的方法：,1.装瓶时，操作要迅速小心。,2.封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。,3.,抑制微生物生长盐，酒，香辛料,。,1.4.1,原理,利用乳酸菌的发酵。乳酸菌是,异养厌氧型,细菌，在无氧条件下，将葡萄糖分解成乳酸。,呼吸方式：,C,6,H,12,O,6,2C,3,H,6,O,3,能量,1.4,泡菜的制作,原料加工,修整、洗涤、晾晒、切分成条状或片状,加调味料装坛,加盐,盐水冷却,泡菜盐水,发酵,成品,测,亚硝酸盐,含量,1.4.2,泡菜的制作过程,1.4.3,讨论,1.,加入白酒有什么作用？,白酒可抑制泡菜表面杂菌的生长，它也是一种调味剂，可增加醇香感。,2.,用水封闭坛口起什么作用？不封闭有什么结果？,水封闭坛口起着使坛内与坛外空气隔绝的作用，制造无氧环境。如不封闭，则会有许多需氧菌生长，蔬菜会腐烂。,3.,为什么泡菜坛内有时会长一层白膜，这层白膜是怎么形成的？,形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌的繁殖。,1.,在制作葡萄酒时，你认为应该先冲洗还是先去除枝梗？为什么？,先冲洗。若先除枝梗，果蒂处造成伤口，易感染杂菌。,2.,果醋的最佳发酵温度是？是否需要通入空气？,3035,，需要通入空气，醋酸菌是好氧细菌。,3.,腐乳制作过程中，其主要作用的菌种是？加盐腌制的目的是？,毛霉。加盐是为了控制毛霉生长，同时可以抑制杂菌的生长。,小结,2.微生物的培养和应用,2.1,微生物,微生物,原核类,:,真核类,非细胞类：,细菌、支原体、放线菌、蓝藻,个体微小、结构简单,酵母菌、霉菌、食用菌,真 菌：,原生生物：,显微藻类、原生生物,病毒、类病毒、朊病毒,微生物的共同特点：,2.1.1,菌落,单个或少数,细菌在固体培养基上大量繁殖时，形成的一个,肉眼可见,的、具有,一定形态结构,的子细胞群体，叫做菌落。,特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。,功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为,菌种鉴定,的重要依据。,碳源：,提供,C,元素的营养物质，,CO,2,；,NaHCO,3,、糖类、脂肪酸、石油,等。,氮源：,提供N元素的营养物质，NH,4+,、NO,3-,、尿素、牛肉膏、蛋白胨等。,生长因子：,微生物生长不可缺少的微量有机物，维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。,无机盐：,K,+,、,Ca,2+,、,SO4,2-,等。,水,微生物培养操作：,器具的灭菌,培养基的配制,培养基的灭菌,倒平板,微生物接种,恒温箱中培养,菌种的保存,2.1.2微生物需要的营养物质,2.2.1,培养基的配置步骤,2.2,培养基的配置,计算称量溶化调,pH,分装灭菌倒平板无菌检查,溶化后,分装前,锥形瓶,或,试管中,培养基,高压蒸气灭菌锅，在压力为,100kPa,、温度为,121,，灭菌,15,30min,。,培养皿,用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在,160,170,下灭菌,2h,。,待培养基冷却到,50,左右时，在酒精灯附近倒平板。防止瓶口的微生物污染培养基。平板冷凝后，倒置使培养基表面的水分更好地挥发，防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染,将灭菌的培养基放入,37,的温室中培养,24,48,小时，以检查灭菌是否彻底。,2.2.2,培养基的种类,划分标准,培养基种类,特点,用途,物理性质,化学成分,用途,不加凝固剂,加凝固剂，如琼脂,工业生产,观察微生物的运动、分类鉴定,微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种,含化学成分不明确的天然物质,工业生产,培养基成分明确,分类、鉴定,在培养基中加入某种化学物质,以,抑制,不需要的微生物的生长,促进,所需要的微生物的生长,培养、分离出特定微生物,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,以鉴别不同种类的微生物,鉴别不同种类微生物,选择培养基,液体培养基,半固体培养基,固体培养基,天然培养基,合成培养基,鉴别培养基,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,半固体培养基：,无动力,有动力,(,弥散,),固体培养基：菌落,2.2.3,无菌技术,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止,杂菌污染,的方法。,消毒：使用较为,温和,的化学或物理方法，杀死,物体表面,或内部的,部分,微生物营养体的过程（不包括芽孢-休眠体和孢子-繁殖体）。,灭菌：是指使用,强烈,的理化因素杀死物体内外,所有的,微生物（包括芽孢和孢子），而达到完全无菌的过程。,无菌技术,具体方法,消毒,煮沸消毒法：,100,煮沸,5-6min,巴氏消毒法：,70-75,下煮,30min,或,80,下煮,15min,（不耐高温的液体）,化学药剂消毒法：用,75%,酒精皮肤消毒,;,氯气消毒水源、消毒水,灭菌,灼烧灭菌：接种环、接种针、试管口,干热灭菌：金属工具、玻璃器皿等,160-170,下加热,1-2h,紫外线灭菌：紫外灯照射30分钟,高压蒸气灭菌：,（培养基常用灭菌方法）,100kPa,、,121,下维持,15-30,min,2.3,微生物的纯化培养,微生物纯化的常用,接种方法有平板划线法,和,稀释涂布平板法。,平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。,2.3,微生物的纯化培养,稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。,特点,平板划线法：,1.,操作的第一步及,每次,划线前、划线结束时都要,灼烧接种环,、,冷却,。,2.,在琼脂固体培养基表面连续划线，每次划线都从,上一次划线的末端,开始，最后区域的划线,不要,与第一区域相连。,3.,不能用于计数,，平板划线法难以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数。,稀释涂布平板法：,1.,能培养成单个菌落。,2.,常用于,计数,，选择菌落数在,30-300,的平板进行计数。,3.,统计的菌落数往往,比活菌数低,，因为当两个或多个菌连在一起时，观察到的是一个菌落。,菌种的保存,临时保藏：,接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于,4,冰箱,保存。,长期保存：,甘油冷冻管藏法,2.4.1,大肠杆菌纯化培养与鉴定,1.,纯化大肠杆菌：平板划线操作或稀释涂布平板操作适宜条件下培养。,2.,鉴定：,采用鉴别培养基，即,在培养基中加,伊红和美蓝,，用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在,大肠杆菌,等,细菌。如果有大肠杆菌，其代谢产物就,与伊红和美蓝结合，,使菌落呈黑色。,2.4,微生物培养、分离、计数和鉴定,1.,分离,选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,2.,鉴别,鉴别培养基：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养分解尿素的细菌，尿素-氨，PH升高，指示剂变红色,2.4.2,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,分离,选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,2.4.2,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,15.0g,琼脂,1.0g,尿素,10.0g,葡萄糖,0.2g,MgSO,4,7H,2,O,2.1g,NaH,2,PO,4,1.4g,KH,2,PO,4,碳源：,葡萄糖、尿素,氮源：,尿素,筛选后需鉴定。,鉴别培养基：不影响微生物生存的酚红培养基，鉴定分解尿素的细菌。,原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强 酚红变红脲酶阳性,鉴定,1.,直接计数法,最常用,显微镜直接计数,法。,先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在显微镜下进行计数。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。,优点：,设备简单、能观察微生物的形态特征。,缺点：,一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。,不能区分死菌和活菌；,难以计数微小的细菌。,计数,2.,间接计数法,最常用
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