分子杂交及相关技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第二节,分子杂交及相关技术,分子杂交,标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程,。,分子杂交包括,：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。,分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。,1,双链probe或DNA解链，主要取决于：,1,链的长度,：链越长，需要的 能量多才能解链；,2,碱基成分,：GC含量高，较难变性；,3,化学环境,：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链,2,一、杂交探针的获得,是指一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。,Probe可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。,3,（一）制备特异性探针所需要的基本条件,1.被检基因结构清楚；,2.有明确的基因产物;,3.已知某一基因产物对表型的反应或缺少某一基因对表型的反应。,具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。,4,（二）特异探针的来源,1、基因组探针：,从已建立的基因组文库中筛选和分离所需的目的基因。,克隆,扩增,大量的,DNA探针,5,DNA克隆,6,2、cDNA probe:从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针。,7,3、寡核苷酸探针,克隆（clone）,:是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。,根据已知基因序列，人工合成一段互补的DNA片段。一般长约1550个bp。多数探针的制备都通过分子克隆的方法获得。,8,二、探针的标记,将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。,常用于标记探针的标识物：,同位素,：,32,P,35,S,3,H-dNTP等；,非同位素,：地高辛-dNTP，生物素-dNTP。,常用的标记方法,：,9,1、缺口平移法（Nick Translation）,原理及过程：,反应体系中,DNA酶I,随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5 3外切酶活性，在缺口处按5 3方向切除单核苷酸；同时,DNA聚合酶I,有5 3的聚合酶活性，在缺口处3端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。,10,Nick Translation,OH,p,OH+,P,P,DNA,dNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I,32P-dNTP,Bio-dNTP,11,2、随机引物法（6核苷酸引物标记法）,原理及过程：,利用E.coli,DNA聚合酶I的Klenow亚单位,，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5 3聚合酶活性。,被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3端为起点，沿模板3 5方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。,12,随机引物标记探针,5,3,5,5,3,DNA,32p-dNTP,Bio-Dntp,6bp primer,Klenow,dNTP,变性-复姓,13,一、DNA杂交常用的方法,（一）.Southern blot,1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因分析方法。,1、原理和步骤:,提取T、Cell DNA,限制酶消化 DNA片段,电泳分离,变性转移至尼龙膜,变性、杂交,洗膜、放射自显影、结果分析,14,Southern Blot,15,2、应 用:,(1)基因组结构分析：,如缺失、插入、倒位等的检测,(2)RFLP连锁分析,16,(,二).斑点杂交(dot and slot hybridization),鉴定核酸序列的简便方法。,1、原理及步骤,：,提取T、Cell DNA,点样品至膜、干燥、固定,探针、DNA变性、杂交,洗膜、放射自显影,结果分析,17,DNA,样品,2、应用：,1）混合样品DNA鉴定,2）基因缺失检测,3）基因表达分析,点样,Probe-,32,P,检测,A,B,1 2 3 4,18,（,三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交，ASO）,该技术应用于当基因的突变部位和性质已完全明确，可以合成ASO探针。探针通常为20bp左右，标记后用于杂交检测。,检测点突变时一般需合成两种探针：,设计：正常探针 5-AGT-3 与正常基因序列杂交,稳定而不与突变基因杂交；,突变探针 5-AAT-3 与突变基因序列杂交,稳定而不与正常基因杂交；,PCR技术可结合ASO，即PCR-ASO技术，以ASO探针检测扩增后的产物突变基因检测。,19,例,:PKU,产前诊断,正常探针,突变探针,1,2,1,2,2进行产前基因诊断,结果分析2为正常个体,20,四、Northern blot,是指DNA-RNA分子杂交，应用特异性基,因探针分析基因的转录水平。,1、原理及步骤：,提取 T、Cell 总 RNA,提纯分离mRNA,琼脂糖凝胶电泳分离RNA,转移至硝酸纤维素膜,杂交检测,21,Norther Blot,22,2、应 用：,（1）.检测mRNA长度分子量大小（依电泳迁移率估计）；,（2）.mRNA的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪，定量分析）,23,五、Western blot,是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法,。,原理及步骤,：,T or cell,提取蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳，分类蛋白,（,SDS-PAGE ）,转移（印迹）于硝酸纤维素膜,加抗体检测某种特异性蛋白质,24,West Blot,25,