课题3　血红蛋白的提取和分离

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,课题,3,血红蛋白的提取和分离,孝义中学 郭丽芬,课标领航,1,概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理。,2,能根据凝胶色谱过程中的现象和结果，评价实验操作的过程是否规范，分析实验结果。,3,尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本过程和方法。,【重点】,凝胶色谱法、电泳法基本原理。,【难点】,实验操作的过程及分析。,血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个,亚铁血红素基团，,此基团可携带,一分子氧或一分子二氧化碳，,血红蛋白因含有,血红素,而呈,红色。,任务,1.,材料的选择,（,1,）为什么选择红细胞为材料？,（,2,）选择什么动物的红细胞为材料？为什么,（,3,）为防止血液凝固，需要做什么？,一、实验设计,选用哺乳动物红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列不是其优点的是,(),A,血红蛋白是有色蛋白,B,红细胞无细胞核,C,红细胞蛋白质含量高,D,红细胞,DNA,含量高,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,任务,2,、确定实验思路,血液,红细胞,血红蛋白,（,1,）血液中除了红细胞，还有什么，怎么得到红细胞？,（,2,）怎么得到血红蛋白？,（,3,）通过你的操作，得到的血红蛋白是纯净的么？还需要做什么？,二、实验操作：,新鲜血液,样品处理,粗分离,纯化,纯度鉴定,（一）样品处理,血液,红细胞,血红蛋白,1,、红细胞的洗涤,2,、血红蛋白的释放,3,、分离血红蛋白溶液,采集得到血液（加入抗凝血剂,柠檬酸钠,）,防止血液凝固,洗涤过程图解：,血液,100mL,3g,柠檬酸钠,低速离心,2 min,红细胞,血 浆,吸出血浆,红细胞,5,倍体积生理盐水,搅拌,10min,重复洗涤,3,次，直至上清液没有黄色,1,、红细胞的洗涤,A,、洗涤目的,:,B,、为什么要低速短时离心？,防止白细胞等一同沉淀（,P69,）,C,、能否用蒸馏水代替生理盐水？,去除杂蛋白,不能，,生理盐水能保持红细胞的渗透压,而不至于破裂，,若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起,，加大分离难度。,D,、为什么要缓慢搅拌？,防止红细胞破裂释放出血红蛋白。,初次离心后的结果,3,次洗涤后的结果,2,、血红蛋白的释放,思考：,释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？,为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析：,蒸馏水的作用是,_,。,加入甲苯的作用是,_,。,充分搅拌的目的是,_,。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,（蒸馏水，,40%,体积的甲苯）,（使用磁力搅拌器充分搅拌）,磁力搅拌器,搅拌器转子,搅拌器正在工作,3.,分离血红蛋白溶液,将搅拌好的混合溶液转移到离心管中，以,2000r/mim,的速度离心,10mim,后，可以看出溶液分为,4,层,第,1,层：（）甲苯层,第2层：,（）色薄层固体,（）,的沉淀层，,第3层:,（）的液体,（）,的水溶液层,第4层:其它杂质（）的沉淀层,无色透明,脂溶性物质,白,血红蛋白,红色透明,暗红色,分离：将试管中的液体,用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的,红色透明液体,。,红细胞,混合液,高速离心,10min,滤纸,过滤,烧杯,离心管,分离过程,思考：,根据材料进行实验设计：现有烧杯一只、透析袋一个、碘液、淀粉溶液、铁架台一个、棉线若干。探究碘液、淀粉是否能通过透析袋。写出实验步骤和结果预测。,（二）粗分离,利用透析袋透析,思考：换成血红蛋白溶液，怎么做？,20mmol/L,磷酸缓冲液,1mL,1mL,1mL,透析过程中如何去除无机盐离子和小分子有机物？,半透膜,大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到,pH,7,的磷酸缓冲液中。,凝胶色谱法原理,：当不同的蛋白质通过凝胶时，（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），,而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,（三)血红蛋白的纯化,1.,2.,3.,凝胶色谱操作,1,、凝胶色谱柱的制作：,取长,40,厘米，内径,1.6,厘米的玻璃管，,两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：,打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用,100,目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端,。,注意事项：,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,顶塞的制作：,打孔安装玻璃管,。,组装：,将上述三者按相应位置组装成一个整体,。,安装其他附属结构。,材料：交联葡聚糖凝胶,G-75,；,20mmol/L,磷酸缓冲液,装填,:,2.,凝胶色谱柱的装填：,步骤,操作要求,立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡,12h,洗涤平衡,一次性缓慢倒入；轻轻敲打,装填悬浮液,凝胶颗粒洗脱液沸水浴,凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀,根据色谱柱体积计算凝胶用量,色谱柱垂直固定在支架上,配制悬浮液,计算称量凝胶,固定色谱柱,3.,样品加入与洗脱,调节缓冲液面：,打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。,滴加透析样品：,吸管吸,1ml,样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,样品渗入凝胶床：,加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。,洗脱：,小心加入,pH=7.0,的,20mmol/l,的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。,收集：,待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每,5ml,收集一试管，连续收集,。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,注意：,正确的加样操作：,1,、不要触及并破坏凝胶面。,2,、贴壁加样。,3,、使吸管管口沿管壁环绕移动。,装配好的凝胶柱,收集得到的纯化后的蛋白,（四）纯度鉴定,电泳,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,判断（）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的,鉴定,。,纯化,原理,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,电泳结果,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,（1）,样品处理：,包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。,（2）,粗分离：,透析除去分子较小的杂质。,（3）,纯化：,通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。,（4）,纯度鉴定：,通过SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,小结,跟踪训练,1,、下列有关提取和分离血红蛋白的叙述不正确的是（,）,A.,样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液,B.,通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取,C.,可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化,D.,可通过,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度,跟踪训练,2,、凝胶色谱柱取长为,40 cm,，内径为,1,6 cm,的玻璃管，有关说法中，不正确的是,(),A,一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果,B,凝胶色谱柱过高超过,1 m,，不影响分离的效果,C,凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度,D,凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大,跟踪训练,3,、,细菌蛋白质在极端环境条件下可通过肽链之间的二硫键维持稳定。已知不同的多肽产物可因分子量不同而以电泳方式分离。下列左图是一个分析细菌蛋白的电泳结果图，“-”代表没加还原剂，“+”代表加有还原剂，还原剂可打断二硫键，“M”代表已知分子量的蛋白质，右侧数字代表蛋白质或多肽的相对分子量。根据左侧结果，下列哪个图案最能代表该细菌原本的多肽结构（注意：“一”代表二硫键,（）,跟踪训练,4,、,如图为DNA测序仪显示的某真核生物DNA片段一条链的碱基排列顺序图片，其中图甲的碱基序列已经解读，其顺序是：GGTTATGCGT。图乙的碱基序列为：(,),A,.,GGTTATGCGT,BCCAATACGCA,C,.,GATGCGTTCG,DGCTTGCGTAG,