琼脂糖凝胶电泳

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,分子生物学,2010,实验,琼脂糖凝胶电,泳检定质粒,DNA,带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳一般分为,自由界面电泳,和,区带电泳,两大类,:,自由界面电泳不需支持物，这类电泳目前已很少使用,;,而区带电泳则需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶,-G,薄层等，分子生物学领域中最常用的是,琼脂糖凝胶电泳，,其优点主要在于操作简单、快速、灵敏。,琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯,DNA,、,RNA,分子混合物的方法，以琼脂糖作,为支持,介质，利用,DNA,分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的,实,验原理,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，,45,开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。,在,pH,值为,8.0,8.3,时，,DNA,分子主要带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。,。,主要实验器材,电泳仪,电泳槽,缓冲液,琼脂糖,凝胶槽,梳子,移液枪,Loading Buffer,琼脂糖,Agarose,（,AG,）：,从石花菜及其他红藻类植物提取出来的一种线状高聚物，由,1,3,连结的,-D-,半乳糖和,1,4,连结的,3,6-,内醚,-L-,半乳糖交替连接起来的长链构，是琼脂中不带电荷的中性组成成份，琼脂糖在,水中一般加热到,90,以上溶解，温度下降到,35-40,时形成良好的半固体状的凝胶,试,剂,溴化,乙锭（,EB,）,为扁平,状分子，是一种荧光染料。,EB,分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光,荧光强度与,DNA,的含量成正比。用肉眼观察，可检测到,5 ng,以上的,DNA,。,同时,EB,也是强致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。,试,剂,琼脂糖凝胶中,DNA,的观察,溴化乙锭（,EB,）,DNA,：紫外光下 红色荧光,上样缓冲液（,Loading Buffer,）：,0.25,溴酚兰；,0.25,二甲苯青；,30,甘油水溶液,作,用：,增加样品密度，使其比重增加，以确保,DNA,均匀沉入加样孔内,在电泳中形成肉眼可见的,指示,带，可预测核酸电泳的速度和位置,使样品呈色，使加样操作更方便,试,剂,核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（,bromophenolblue,Bb,）呈蓝紫色；二甲苯青（,xylenecyanol,Xc,）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢,电,泳缓冲,液：,指在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有：,TAE,、,TBE,等,TAE,是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（,TBE,中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状,DNA,在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约,10%,，电泳大于,13kb,的片段时用,TAE,缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收,DNA,片段时也易用,TAE,缓冲系统进行电泳。,TAE,的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换,。,TBE,的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用,TBE,，并且当用于电泳小于,1kb,的片段时分离效果更好。,TBE,用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使,DNA,片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。,试,剂,实验操作,制备琼脂凝胶,加,样,电泳,紫外透射仪检测,（,1,）制胶,（,以,30 mL1%,琼脂,糖凝胶的为,例）,a.,称取,0.3,g,琼脂糖，加,入,30,ml,的,1,电泳缓,冲,液摇,匀,；,操,作步骤,溶 胶,b.,加热至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出）；,待凝,胶冷却至,50C,，加,EB,至终浓度,0.5g/ml,，混,匀,铺 胶,c.,将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，,将混匀,后,的琼,脂,糖倒,入其中，直至厚度为,4,6 mm,，在室温下冷却至其凝固,(,约,30 45 min),凝胶凝固后取出梳子,d.,小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好,将胶板置于电泳槽中。,向电泳槽中加入,0.5x,电泳缓冲液至刚没过凝胶表面,12mm,（,2,）点样：,吸,取,5ul,的,DNA,样,品，点在点样板上，再吸取,6,上样缓冲,液,1ul,，,混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内,。,注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。,（,3,）,电泳：,打开,电源开关，调节电压,至,80V,可见,到溴酚蓝条带由负极向正极移动，,约,25,分钟即,可观察结果。根据指示剂泳动的位置，判断是否终止,电泳（当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿,12cm,处，停止电泳）。,（,4,）,观察：,将,电泳好的胶,置于凝胶成像系统上,，打开紫外灯，,可见橙红色,核酸条带，根据条带粗细，可粗略,估计样品,DNA,的浓度。如同时有已知分子量的标准,DNA,进行电泳，则可通过线性,DNA,条带的相对位置初步估计样品的分子量。,附 注：,影,响,DNA,在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：,1)DNA,分子大小,2)DNA,构象：,一般迁移速率超螺旋环状,线状,DNA,单链开环。,3),所加电压：低电压时，线状,DNA,片段的迁移速率与所加,电压,成正比。,logN,1,V=,（,V,：迁移速率,N,：碱基对数目）,4),琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的,DNA,琼脂糖浓度（,%,）分离范围（,kb,）,0.3 5-60,0.6 1-20,0.7 0.8-10,0.9 0.5-7,1.2 0.4-6,1.5 0.2-4,2.0 0.1-3,5,),嵌入染料的存在：降低线性,DNA,迁移率。,6),电泳缓冲液的组成及其离子强度影响,DNA,的迁移率，无离,子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔,化凝胶并导致,DNA,变性，一般采用,1TAE,，,1TBE,，,1TPE,（均含,EDTApH8.0,）。,注意事项,1,、倒胶时把握好胶的温度，不要高于,60,，否则温度太高会使制板变形；,2,、胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔；,3,、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不要刺穿凝胶；,4,、,EB,有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔；,