分子生物学--核酸的生物合成

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章 核酸的生物合成,第十章 核酸的生物合成,第一节,DNA,的生物合成,一、,DNA,的半保留复制,复制,：,以亲代,DNA,分子为模板指导合成相同的子代,DNA,分子的过程,。,Meselson,等用氮的同位素进行了试验证明了,DNA,复制为半保留复制机理,半,保留复制,：,DNA,复制时以亲代,DNA,两条链为模板指导合成与其互补的,DNA,链，这样在子代,DNA,中，一条链来于亲代,DNA,，,另一条链是新合成的。,DNA,的这种复制方式称为半保留复制,15,N/,15,N,用含,15,N,氯化铵连续培养许多代,半,保留复制试验,14,N/,15,N,用含,14,N,培养基培养,1,代,14,N/,14,N,14,N/,15,N,用含,14,N,培养基培养,1,代,1.DNA,聚合酶,：催化反应的要点：,底物：,四种,dNTP,（,dATP,、,dGTP,、,dCTP,、,dTTP,）,模板：,DNA,链,聚合方式：,按照,碱基配对原则,，将相应,dNTP,的,5,磷酸与上一个核苷酸的,3,羟基形成,3,5,磷酸二酯键，即,合成方向为,5 3,，与模板链反平行,。,条件：,聚合反应必须,有引物,存在。,二、参与,DNA,复制的酶和辅助因子,dNTP,+,核苷酸链,n,PPi,+,核苷酸,链,n+1,DNA,聚合酶,PPi,+H,2,O 2Pi,焦磷酸酶,DNA,聚合酶催化机理,（,1,）,大肠杆菌,DNA,聚合酶,：共有三种，,为,DNA,聚合酶,I,、,II,、,III,I,II,III,亚基数,1,4,10,M.W,103 000,88 000,830 000,聚合作用,连续聚合作用,小,较小,很大,聚合速度,(N/s),16,20,40,250,1000,5,3,外切酶,3,5,外切酶,功能,复制中去除引物填补缺口,参与损伤修复,可能参与损伤修复,DNA,复制的主要酶,2.,引发酶,功能：可以从无到有地以,DNA,为模板，催化合成,一小段与,DNA,互补的,RNA,即引物,（,10,个核苷酸左右）。,引物酶本身无活性，只有与另外,6,种蛋白质结合为,引发体,才可催化引物的合成。,（,2,）,真核生物,DNA,聚合酶,：共有四种，为,DNA,聚合酶,a,、,b,、,g,、,d,a,b,g,d,功 能,复制的主要酶，与后随链合成有关,DNA,损伤修复,线粒体,DNA,的复制,复制的主要酶，与先导链合成有关,3.,DNA,连接酶,功能,：,将复制过程中形成的,DNA,片段用,3,5,磷酸二酯键连接起来。,酶,酶,（部分细菌）,4.,DNA,解螺旋酶（解链酶）,利用,ATP,供应能量，水解碱基间氢键，从而打开,DNA,双螺旋的双链,5.,单链结合蛋白（,SSB,）,可与由解链酶解开的单链结合,功能,：,防止单链再次形成双链，防止核酸酶水解多核苷酸链，保护,DNA,。,可以,重复使用,，即当所结合的单链进行复制时，它就发生解离，而与新解开的单链结合。,5,3,5,3,5,3,5,5,3,6.,DNA,拓扑异构酶,通过催化,DNA,拓扑结构的变化，,减少由于解链形成的张力和合成的子代,DNA,形成双螺旋。,7.,其它因子,解链,双螺旋存在张力,DNA,拓扑异构酶,II,张力解除,复制起点,1.,起始,DNA,分子上有特定的起始位点。在一些因子的作用下，,DNA,部分解链，形成了一个“,复制眼,”,三、,大肠杆菌,DNA,的复制过程,复制叉模型,DNA,分子中正在复制的部位，称为复制叉。它是由两股解开的亲代链和在其上新合成的子链、酶、因子组成。,引物体,引物酶,因子,解,螺旋酶,SSB(,单链结合蛋白,),5,5,3,3,复制叉移动方向,DNA,聚合酶,DNA 5,DNA 3,3,5,A-T-G-G-C-A-A-A-T,T-A-C-C-G-T-T-T-A,RNA 5,DNA 3,3,5,A-T-G-C-C-A-G-A-T,U-A-C-G-G-U-C-U-A,5,5,3,3,5,3,5,5,3,3,5,3,5,5,3,ATP,GTP,UTP,CTP,PPi,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,PPi,DNA,聚合酶,2.,延长,5,3,5,5,3,5,3,5,5,3,5,5,3,3,3,5,5,3,5,5,3,3,3,5,3,5,3,5,5,3,5,3,3,5,5,3,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,3,5,5,3,5,冈崎,片段,（,Okazaki,fragment,）,原核生物,10002000,个核苷酸,复制机理：半不连续复制,A,T,T,G,C,U,G,T,A,A,C,G,A,C,A,A,U,U,G,C,U,G,T,A,A,C,G,A,C,A,U,U,G,C,U,G,T,A,A,C,G,A,C,A,T,U,G,C,U,G,T,A,A,C,G,A,C,A,dTTP,U,dTTP,U,A,U,U,G,C,U,G,T,A,A,C,G,A,C,dATP,dGTP,G,C,U,G,dCTP,dTTP,dGTP,DNA,聚合酶,I,A,T,T,G,C,T,G,T,A,A,C,G,A,C,A,A,T,T,G,C,T,G,T,A,A,C,G,A,C,A,A,T,T,G,C,T,G,T,A,A,C,G,A,C,A,ATP或NAD,AMP或NMN,连接酶,A,T,T,G,C,T,G,T,A,A,C,G,A,C,A,D,D,C,C,B,B,A,5,3,5,3,3,5,3,5,连续链,不连续链,先导链,后随链,(,滞后链,),DNA,复制机理,3,5,3,5,DNA,聚合酶,I,5,3,3,5,连接酶,SSB,引物体,DNA,聚合酶,III,解螺旋酶,DNA,复制系统,DNA,拓扑异构酶,I,DNA,拓扑异构酶,II,3.,终止,DNA,复制无特定终止位点，复制链到达前面已复制成的片,段则自动终止,四、,原核与真核细胞,DNA,复制的特点,1.,原核细胞,DNA,复制的特点,：单个起点，多数为双向复制，少数为单向复制,2.,真核细胞,DNA,复制的特点,：真核细胞,DNA,复制与原核细胞,DNA,复制系统及过程基本相同，不同之处在于：,（,1,）,多个起点,（,2,）,均为双向复制,（,3,）,酶系统,：,DNA,聚合酶不同,，原核细胞两条链是同一种聚合酶催化，真核细胞中是不同聚合酶催化。,去除引物、填补缺口的酶不同,，原核细胞中是,DNA,聚合酶,I,，,真核细胞相应的酶还未找到。,因子不同,1.,概念,以,RNA,为,模板合成,DNA,的过程,2.,反转录酶,存在于真核生物的,RNA,肿瘤病毒中。,催化特性：以四种,dNTP,为底物，需模板和引物。,以病毒,RNA,为模板，合成互补,DNA,。,具有核糖核酸酶功能，水解,RNADNA,杂合分子中的,RNA,。,以自己合成的,DNA,链为,模板合成互补的,DNA,，,从而形成双螺旋分子。,催化过程：,DNA,RNA,五、,反转录（逆转录）,六、,基因扩增（人工体外合成,DNA,）,加热,降温,引物、底物,循环操作,聚合酶链式反应（,PCR,）,系统,：模板（,DNA,片段）、酶、引物、底物（,4,种,dNTP,）,过程,：,PCR,过程,第二节,RNA,的生物合成,一、,概念,转录,：,以,DNA,为模板合成,RNA,的过程,不对称转录,：,以,DNA,一条链为模板转录,RNA,的方式,5,3,3,3,5,5,DNA,RNA,转录方向,反意义链,（模板链、,编码链、（）链）,有意义链,（非模板链、,非编码链、（,+,）链）,转录单位,：,DNA,中,指导转录一条,RNA,链的全部序列。,二、,大肠杆菌,RNA,的转录,1.,E.coli,RNA,聚合酶,：以四种,NTP,（,ATP,、,GTP,、,CTP,、,UTP,）,为,底物,，以,DNA,链为,模板,，按照,碱基配对原则,，将相应的,NTP,的,5,磷酸与上一个核苷酸的,3,羟基形成,3,5,磷酸二酯键，即,合成方向为,5 3,。聚合反应,不需要引物,。,RNA,聚合酶催化机理,A,A,G,A,G,T,C,T,C,U,C,U,OH,HO,OH,G,GTP,RNA,模板,DNA,5,3,3,5,OH,OH,OH,OH,A,G,A,G,T,C,T,C,A,U,C,U,OH,HO,G,3,3,5,5,OH,OH,OH,OH,结构：,2,全,酶,（转录起始）,+,核心酶,（转录延长）,重复使用,MW40000,结合启动子,MW155000,催化,MW160000,结合模板,MW70000,识别启动子、起始,2.,转录过程,（,1,）,起始,：起始区在转录单位的启动子部位。,启动子,转录起始过程中，,RNA,聚合酶识别、结合并开始转录,DNA,序列,。,由三部分组成，,RNA,聚合酶,识别序列,、,RNA,聚合酶,结合序列,和,解链并开始转录位点,。,识别序列,结合序列,起始位点,启动子,识别,识别序列,结合序列,起始位点,启动子,RNA,聚合酶（全酶）,结合,转录开始,转录起始,（,2,）,延伸,：在,RNA,聚合酶催化下，以模板链为模板按,5 3,方向,合成互补的,RNA,链,5,5,3,3,5,3,RNA,聚合酶,DNA,RNA,转录延长,RNA,RNA,聚合酶,终止的方式,：,（,1,）,强终止,只依靠终止子就可使,RNA,转录终止，并释放合成的,RNA,链和,RNA,聚合酶。又叫不依赖于,因子的终止。,（,3,）,终止,：,RNA,聚合酶到达转录终止区，则停止转录。,终止子,能够使,RNA,转录停止,DNA,序列,。,强,终止机理,（,2,）,弱终止,不仅需要终止子，而且需要,因子才能停止转录并释放,RNA,和,RNA,聚合酶的终止方式。又叫依赖于,因子的终止,转录停止,因子,RNA,RNA,聚合酶,因子,弱,终止机理,RNA,转录过程,RNA,聚合酶（全酶）,启动子,DNA,终止子,5,5,3,3,RNA,RNA,聚合酶（核心酶）,再与,RNA,聚合酶结合,起始,终止,延长,真核细胞,RNA,的转录机理与原核,RNA,转录机理基本相同。主要不同之处为：,1.,启动子复杂,2.,需要多种因子参与,3.,RNA,聚合酶不同,。真核,RNA,聚合酶有三种，即,RNA,聚合酶,I,、,II,、,III,，,它们的性质与功能如下：,类型,I,II,III,核内分布,亚基,产物,a,-,鹅膏蕈碱,效应,核仁,rRNA,前体,不敏感,核质,12,个,hnRNA,(mRNA,前体,),高度敏感,核质,tRNA,和,5SrRNA,中度敏感,另外，线粒体、叶绿体也有各自的转录系统，转录各自的,RNA,。,三、,真核细胞,RNA,的转录,四、,RNA,转录后的加工,1.,rRNA,加工,（,1,）,剪接,：如原核细胞,rRNA,前体的加工,（,2,）,修饰,：主要是甲基化,M16:16S,rRNA,成熟酶,M23:23S,rRNA,成熟酶,M5:5S,rRNA,成熟酶,M16,M16,M23,M23,M5,16S,rRNA,tRNA,23S,rRNA,5S,rRNA,tRNA,16S,rRNA,23S,rRNA,5S,rRNA,tRNA,tRNA,III,III,III,III,E,E,III:,RNaseIII,E:,RNaseE,2.,tRNA,的,加工,（,1,）,剪切,RNaseP,RNaseF,RNaseD,(2),修饰,：,3,加,CCA,。,剪切加工后，全部的真核,tRNA,和原核细胞中一大类,tRNA,无,3,端的,CCA,，,需要在修饰加工中加上。,2CTP,ATP,A,C,C,其它修饰,：如还原、糖苷键移位、甲基化等。,3.,真核,mRNA,的加工,（,1,）,5,加帽子，,3,加尾巴,尾巴,帽子,GTP,、,甲基供体,n ATP,hnRNA,mRNA,（,2,）,剪接,：真核细胞的蛋白质基因是,断裂基因,，即一个基因