流式细胞术贝克曼课件

Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,应用分类,1、膜表面抗原和胞浆内蛋白分析,2、,DNA,含量及细胞周期分析,3、定量分析,4、细胞功能分析,5、凋亡研究,6、细胞间相互左右,7、细胞分选,1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态,2.白血病/淋巴瘤免疫分型,3.,HLA,组织配型及,HLA,与某些疾病的关系,4.干祖细胞的定量及成分分析.,5.其它:,粘附分子;,TCR,多态性检测;肿瘤癌基因及,抑癌基因蛋白产物的检测;,细胞内酶;耐药蛋,白,的分析等等。,临床应用,疾病诊断,:,为疾病诊断提供直接的或支持诊断的依据,免疫调节,：细胞因子/受体的相互作用,共刺激分子受体/配体的相互作用,发病机理,：,肿瘤的发病与机体的免疫力低下、以及信号传递,障碍有关,药物/疫苗效果的评价,：,肿瘤生物治疗的时机选择、以及效果,的监测,免疫状态评价,：,移植、放化疗等.,细胞周期分析:,在细胞周期(,G0，G1，S，G2，M),的各个时期，,DNA,的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记,DNA，,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出,G0/G1%，S%,及,G2/M%。,了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（,CYCLIN）、Ki67、,核增殖抗原（,PCNA）,等，对细胞周期进行精确的分期：,G0、G1、S、G2、M.,DNA,含量及细胞周期分析,G,2,M,G,0,G,1,s,0,200,400,600,800,1000,G,0,G,1,s,G,2,M,DNA Analysis,DNA content,Count,2,N,4,N,Normal Cell Cycle,1.肿瘤的早期诊断。,2.肿瘤的良恶性判断。,3.观察细胞的增殖状态及周期分布。,4.疗效监测,细胞功能分析,1.吞噬功能试验,2.氧爆发试验,3.根据,T,淋巴细胞分泌细胞因子的不同将,CD4+,或,CD8+,分为介导细胞免疫的,I,型细胞和介导体液,免疫的,II,型细胞,.,4.,药物泵的功能检测,5.,NK,细胞的肿瘤杀伤活性检测,6.血小板的粘附,聚集功能检测,树突状细胞分析（,Dendritic Cells,DC),DC,是主要的抗原递呈细胞，同时又是重要的先天免疫细胞，还是具有免疫调控功能的一个细胞群，没有发现特异性的抗原标记,DC,研究的主要内容包括直接分析计数、体外诱导检测,一般分为两群,PDC,MDC,当前,DC,检测的方法：,1）,Lin-,CD11c,CD123,同时可能表达,CD80,CD86,CD83,DR,等,2）利用,BDCA1,2,3,4,对外周血或其它组织,DC,进行分析,3）,CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123,T,细胞分析,相对计数,淋巴细胞亚群数量检查项目和意义,疾病,CD3,CD4,CD8,CD4/CD8,NK,自身免疫病,降低,增高,降低,降低,AIDS,降低,严重降低,增高,降低,SARS,降低,降低,降低,降低,降低,慢性活动性肝炎、肝硬化,降低,正常或,增高,降低,降低,肿瘤,降低,降低,增高,降低,降低,CD4,细胞绝对计数,对,AIDS,病人的诊断、疗效和预后有重要的指导意义，一般认为,CUTOFF,值为200/,ul.,绝对计数是加入浓度已知的标准微球与标本一起测定，流式细胞仪控制软件在设置后能自动计算出浓度,对任何细胞群体都可以进行绝对计数,Th1Th2,细胞因子分泌细胞测定,根据产生的细胞因子的类型和生物学功能,人的4+细胞可以分为1、2,1细胞产生 2、12、,、,等细胞因子,主要参与细胞介导的免疫反应、迟发性过敏反应,并在清除病毒等细胞内致病因子方面起着重要作用,2细胞分泌 4、5、6、10、13等细胞因子,主要促进体液免疫反应,中和胞外病原体,相应地，,CD8+T,细胞也可以分为,Tc1,和,Tc2,Th1,细胞：,介导细胞免疫、细胞毒性,T,细胞的,生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。,Th2,细胞：,介导体液免疫，促进,B,细胞的生长、活化和分化，是,IgG1,和,IgE,类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高,IgE,综合症和嗜酸性粒细胞增多症。,Th1Th2,检测,Tips,一定要确定,T,细胞是否已经活化，细胞转运阻滞是否成功，胞膜打孔是否有效,一定要用胞浆内同型对照（特别是,FITC,标记时），以便分别部分弱表达的细胞因子。,TETRAMER,抗原递呈细胞（,APC）,携带抗原片段通过与,TCR,复合物结合，在,APC,和,T,细胞的,MHC,相容和其它共刺激分子的相互作用下激活,T,细胞并产生细胞免疫效应。,MHC-,四聚体染色技术用于抗原特异性,T,细胞分析的原理在于体外模仿上述抗原递呈的过程来实现对特异性,T,细胞的鉴定，通过流式细胞仪这种高通量分析仪器对标本中这群细胞进行分析,四聚体技术的优势是：可以对特异性免疫细胞进行定量；用流式细胞仪检测可以快速测定大量细胞，可以同时进行其它表面染色，可以直接用外周血测定而不需要培养；四聚体染色不会杀伤细胞，因此染色后的细胞可以进行分选或其它功能分析；四聚体对所有的特异性,T,细胞都能够结合，而不仅仅是对,有功能的细胞进行检测。,不同厂家的,MHC,四聚体产品不太一样：贝克曼库尔特公司创造性地构建和表达了,MHC,分子,3,链的区域突变的蛋白（,iTAg），,能降低其与非特异性,T,细胞结合，大大提高了特异性。并且将,MHC,四聚体直接标记荧光，和常用的抗原多肽负载后整体商品化，也有单独的,MHC,分子（,iTAg）,单独出售，极大方便了研究者,CD4CD25 Treg,调控性,T,细胞的主要功能是抑制机体免疫功能，太强则免疫耐受，太弱会引起自身免疫反应,调控性,T,细胞调节抗原递呈细胞对抗原的递呈,调控性,T,细胞的表型是,CD4+CD25bright，,逐渐发现越来越多的其它分子可能能够更精确限定（,eg.FOX-1?),CD25,也是免疫细胞晚期活化的标记，但表达的平均荧光强度不足够强,非特异性的先天免疫细胞,细胞:占外周血,T,细胞的10以下，非抗原依赖型免疫细胞，在传染病、肿瘤病人外周血数量增加，表达,CD3,量较普通,T,细胞多,NK,细胞：占外周血淋巴细胞825，传染病和肿瘤病人数量偏低。,NK,细胞可以根据,NKR,的不同而分类，丙型肝炎的发生和预后可能与,NK,细胞的表型相关,DC：,分布与淋巴组织和外周血，为非成熟状态，遇到相应的抗原后主要分泌,IFN-alpha,来发挥左右,其它重要分子的流式分析的意义,粘附分子：物种间高度保守，与细胞间通讯，干细胞,HOMING，,肿瘤的发生可能有很重要的关系，如,CD11C/CD18-CD54,与,DC,成熟和迁移有关；,CD209-CD102,与抗原递呈有关,CD26:,移植后造血干细胞表达可能不利于该细胞的,homing，,有证据表明抑制造血干细胞有利用移植成功,流式细胞术在移植中的应用,移植配型和群体反应性抗体的检测,荧光示踪标记的移植细胞：,CFSE,是一个确定的荧光标记物，开发其它稳定的荧光素应该更有帮助,流式细胞仪分选,为达到最高的分选效率，实用中最好先用磁珠分选系统进行初步分选,活细胞分选非常有用,流式细胞术在生物医学研究的新方向,细胞多态性分析：受体、抗原折叠、,HLA,等，包括,CXCR4,CCR5,DC-SIGN(,与,AIDS,易感性有关），,NKR(,中国科大研究领先项目）,信号传导（实际主要为胞浆内磷酸化及去磷酸化蛋白的检测）,新型荧光特异性探针：胞内病原体检测、转录因子检测、细胞器或细胞生命活动指标的新荧光素的应用,利用分选的细胞进行体内和体外功能研究,与其它定位性的荧光设备联合使用（如,MPE,CONFOCAL,IC100,等）,Cell Lab IC 100,Complete data mining and analysis,Flexible Analysis,Plug-in architecture,Scalable across an enterprise,细胞群定量,流式细胞仪是一个高通量的开发系统，随着新抗体和新标记的发现和开发，将在疾病诊断和生物医学的研究方面为大家发挥更大的作用,