基因操作原理04

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章,大分子的分离和分析,一、,E.coli,质粒,DNA,的分离和纯化,1,质粒,DNA,的小量提取,第一节,DNA,的分离、检测和纯化,1,质粒,DNA,的小量提取, 步骤性原理,在碱性条件下，线状,DNA,变性，质粒,DNA,维持环状，高盐条件下复性，除质粒,DNA,外，形成沉淀。, 步骤,细菌培养物的生长、时间、量,细菌的收获和裂解,质粒,DNA,的纯化（,苯酚,/,氯仿 梯度离心）,Sol I,Tris-HCl, EDTA, Glucose,Sol II,NaOH,-SDS,Sol III 3M,KAc,DNA purification Kit (,QiaGen,),二、,DNA,的电泳检测,主要检测：分子量，含量及有无,1.,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖 从海藻中提取的一种线状高聚物,常规熔点,低熔点,Gelling point 25 20-30,Melting point,65,电压 迁移率与电压成正比,2kb,应,5 U/cm,电场方向,单一方向 负 正 脉冲电场 几百,kb,以上,温度,4-30,，,0.5% or,低熔点,4,buffer TAE TBE TPE 50mM (pH7.5,8.0),碱性,agarose,电泳,用于分析,ssDNA,/Southern,杂交,londing,buff,溴酚蓝,/,二甲苯菁,FF 40% Sucrose,染色,/,摄影,EBt,0.5,g/ml,10mg/ml store,(,棕色瓶,or,铅铂纸,),UV,波长：长,366nm,短,254,一般,302,2.,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE,）,优点,:,分离率高,1,bp,点样量高,10,g,回收的,DNA,纯度高,非变性,:,迁移率与序列和组成有关,变性,(,尿素,/,甲醛,):,无关，分离探针，,S1,酸产物分析，,DNA,测序,三、,DNA,片段的纯化（从,agarose,）,1.,低熔点,agarose,电泳,gel + 5vol,tris,65, 5min phenol extract ethanol,2.,透析袋，电洗脱法,可用于,5kb,3.Glass Milk (bead),3M,NaI,溶液，,bead,吸附 洗涤,elute,4.Kit,Qiagen,公司,一个典型哺乳动物细胞约含,10,-5,g RNA,，其中,80-85%,为,rRNA(28S,18S,和,5S/23S,16S,5S),三种类型,),，其余,15,20%,主要由各种类型的低分子量,RNA,组成（如,tRNA,，核内小分子,RNA,等）。,mRNA,为总,RNA,的,1,5%,，,3,端有一个,poly(A,),尾，可与,oligo(dT,)-,纤维素，吸附，亲和层析分离寡脱氧胸苷酸。,第二节,RNA,的分离、纯化和检测,一、注意事项,-,控制,RNA,酶的活性,(,一,),实验用具和溶液的去,RNA,酶处理,1.,玻璃制品、塑料制品、电泳槽,一次性使用用品,/,第一次使用的用具，可稍作处理,器皿：,180 8hr or longer,，,氯仿冲洗,/,NaOH,/,专用溶液,0.1% DEPC(,焦碳酸二乙酯,),、浸泡,(37,，,2hr),(RNA,酶的强列抑制剂，但不绝对,),无菌水,(or DEPC,水,),洗涤,100,烤,15min,湿热灭菌,电泳槽,:,洗净,水冲洗,乙醇干燥,3%H,2,O,2,10min,0.1% DEPC H,2,O,水洗,2,H,2,O,：,0.1% DEPC,溶液：用,DEPC,水配制,（注意有些药品，不能用,DEPC,如,Tris,）,3,其它,如手套，保持干净、清洁,（二）,RNA,酶抑制剂,1,蛋白质抑制剂,人胎盘,RNase,抑制剂,2,氧铜核糖核苷复合物,100%,抑制（且抑制体外翻译）,3,硅藻土，吸附,RNase,二、,RNA,的抽提,1,文献法,2,Kit,Gibco/TR1ZOL Reagent 100ml 99.8USD,酚,+,异硫氰酸胍,Qiagen/RNAeasy,三、纯化,1,蛋白质的去除（见上）,2,DNA,的去除,DNase,I,（,RNase,free,）,inhibitor,3,Kit,4,梯度离心,四、,mRNA,的纯化,1,亲和层析,2,纯度检测,OD260: 1=40,g/ml RNA,五、电泳,1,琼脂糖凝胶,氢氧化甲基汞 甲醛,乙二醛,-,二甲基亚矾（,DMSO,）,2,PAGE,1,检测蛋白质分子量,2,Western blot,3,N-,torminal,amino acid sequence,第三节,蛋白质的,SDS-PAGE,第四节,分子杂交,molecular hybridization,1.,根据被杂交的对象分为,Southern,Northern,Western,Dot,colony(plaque,),2.,denature,变性,：热，极端,pH,，有机溶剂，尿素,annealing,复性,：,互补单链重新配对恢复成双链为复性,hybridization,杂交,：,同源单链重新配对恢复成双链为杂性,一、,Southern blot,(,一,),DNA,片段的转移,1,酶切,2,电泳,/,照相,中性碱性（,0.4N,NaOH,）,3.,变性,/,中和,大片段 脱嘌呤,0.2N,HCl,10min,0.5N NaOH/1.5M,NaCl,1M Tris(pH7.4)/1.5M,NaCl,4.,转移,Nitrocellulose membrane NC,nylon membrane (charged or not),6,SSC (or SSPE),转移,buffer,毛细管 电转移 真空,滤纸,凝胶,滤膜,吸水纸,玻璃板,重物,支持物,500g,时间,: 15kb 18hr,5,固定,80 2hr, UV, microwave,(,二,),杂交,hybridization,1.,预杂交,prehybridization,6,SSC,Denhardt(50x),：,(,含,Ficoll,聚乙烯比咯烷酮,),变性鱼精,DNA,0.5% SDS,其他,预,杂交液,:,脱脂牛奶,ExpressHyb,(,Clontech,公司,) (1-2 Hr),2.,杂交,探针处理,温度,42,50%,甲酰胺,时间,6-8,小时,探针：,DNA,Oligo,随机,DNA,3.,洗膜,2,SSC/0.5% SDS 15min RT,0.1,SSC/0.5 % SDS 1hr at,杂交温度,（三）检测,X-film or,生化,Phosphor image,（四）探针的标记,probe labeling,1,均一标记,切口平移,nick,traslation,:,E.coli,DNA,polyI,随机引物,random primer:,6Nt or 6,12nt,klenow,2,单链探针,ssDNA,模板，通用引物，合成,ssDNA,探针,RNA,探针，,RNA polymerase,3,末端标记,Klenow,标记,3,端,补平和置换反应,T4 polymerase,标记,3,端,3,-5,外物活性强，特别适用于,3,突出末端,Kinase,标记,5,端,正反应,32,P,5,-OH NNNN,5pNNNN,交换反应,过量,ATP,使,5,-P,ADP then,32,P,5,末端转移酶标记,3,4,寡核苷酸,Kinase,末端转移酶,5,标记物,放射性,:,32,P,，,33,P,，,35,S,非放射性,:,DIGoxigenin,Biotin,标记,dUTP,(,五,) DIG,标记,/,检测举例,1.,探针标记,6,Nt,随机寡核序列苷酸引物,Klenow,标记,2,检测,漂洗,blocking,免疫反应,labeled Anti-,DiG-Ab-Ap,洗涤,显色反应 化学发光检测,NBT-BCIP,形成棕黄色沉淀,BCIP,：,5-,溴,-4-,氯,-3,吲哚磷酸,NBT:,氯化硝基四氮唑蓝（染料色素）,CIP,的底物,也称氮蓝四唑,优点：无污染，方便，探针可重复使用，可控制显色反应，保存杂交膜，易辩别真假阳性,缺点：灵敏度不够，不能多次杂交，,只有,0.1pg,可检测单拷贝，如,g,人胎盘,DNA,中的单拷贝,二、原位杂交,菌落杂交和空斑杂交,1.,菌落生长,点种,:,将阳性重组子,二个平板上,(,有,/,无膜,),加,CK,影印,:,菌落和空斑，绝大多数应为重组子,(,白色菌落,),2,DNA,的释放与固定,有多种方法,10%SDS,； ,0.5N NaOH/1.5N,NaCl, 0.5M,Tris,1.5N,NaCl, SSC,干燥 固定,80 2hr,三、斑点杂交,类似上述方法，直接将,DNA,样品点在杂交膜上。,四、,Northern blot,类似于,Southern blot,但用于检测,RNA,的分子杂交技术,用于分析总,RNA,或,mRNA,。,1,电泳缓冲液, 甲醛,buf,(5,),0.1mM MOPS(pH2.0) (3-(N-,玛琳代,),丙磺酸,),40mM,NaAc,5mM EDTA(pH8.0),DEPC H2O,制胶,甲醇（,MW 30.03,）通常为,37%,水溶液，,12.3M,（,pH4.0,）,终浓度，,1,buf + 2.2M,甲醇,2,上样,预处理,RNA,（,up to 30,g,）,4.5,l+5,buf 2.0,l,甲醛,3.5,l,甲酰胺,10,l,65,15min,loading,buf,50%,甘油，,1mM EDTA(pH8.0),0.25% BPB 0.255,二甲苯,TFF,3,电泳,loading,之前，预电泳,5min 5V/cm,电泳,1,2hr,后，混合正负极电泳液,4,转膜,预处理,DEPC H2O,洗涤去除甲醛,if,agarose,10% or,厚度,0.5cm or 2.5kb,需用,0.05M,NaOH,处理,20min,部分水解,RNA,无,RNase,H2O,洗涤, 20,SSC,浸泡,45min,转移,同,Southern,五、,Western blot,基本原理同其它,blot,方式,检测,蛋白质,与,Southern,的关键区别在于探针性质,:,抗体,(,一,),抗体的要求,1,单克隆抗体,但并非都适合，由于靶蛋白已变性。,2,多克隆抗体,抗体为混合物，对其特异性,亲和力及浓度都一无所知,对由,SDS/,还原剂变性处理的目标蛋白是否还能识别,应做预备实验,(,二,),简要步骤,1,样品制备,SDS-PAGE,样品,2,running SDS-PAGE,3,蛋白质转移,硝酸纤维素滤膜，电转移,:,三夹板,/,隔离电极板,干燥,4,染色,丽春红,S or,印度墨水（射启性检测适用）,但现少采用，由于有,prestain,MW marker,5,封闭背景 脱脂奶粉,5%,6,第一抗体与靶蛋白结合,7,二级免疫反应,抗免疫球蛋白抗体 或,A,蛋白,A,蛋白可与,IgG,的,Fc,片段,binding,木瓜蛋白酶切割,IgG,Fragment antigen binding, Fragment crystalline,标记：,125,I,碱性磷酸酶 辣根过氧化物酶,偶联,8,检测,辣根（,HRP, horseradish,peroxidase,）,与,3.3-,二氨基联苯胺作用形成,棕色沉淀,钴或镍可加深颜色，提高灵敏度,但不可完全排除背景，应小心使用,Ap,见前面,125,I,放射自显影,六、蛋白质,N,末端序列测定,1,电泳,2,转移,PVDF 0.2,m,3,染色,/,脱色,4,干燥、检测,七、,RNA,端点分析,1. S1,酶作图,标记寡核苷酸, PAGE,电泳检测,MW,5,3,ATG,UAG,S1,酶,S1,酶,还可检测前体,RNA-mRNA,的剪接点,2. Primer extension,