蛋白质浓度测定方法比较

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1、0.1g 细胞 2ml epp，混匀。,2、700l bufferA，65，10m，中间混匀一次,3、苯酚350l，氯仿(l fn)350l，混匀3m，12000rpm，5m,4、上清500l 至1.5ml epp，500l等体积氯仿，混匀3m，12000rpm，10m,5、上清400l到1.5ml epp，异丙醇400l0.7-1，12000rpm，2m，掏出DNA，毛细管,6、沉淀用70%乙醇洗2次，每次3m,7、自然凉干10m，30lTE，充分溶解,8、琼脂糖凝胶电泳鉴定,第一页，共十五页。,蛋白质浓度(nngd)测定方法比较,第二页，共十五页。,一、实验,(shyn),目的,学习(xux)三种蛋白质浓度的测定方法，并比较优缺点。,第三页，共十五页。,二、实验,(shyn),原理与步骤,OH,磷钼酸、磷钨酸,Pr+CuSO4 Pr-Cu络合物紫红色蓝色化合物,蛋白质测定的范围：,25,250g/mL,标准蛋白,(dnbi),BSA 250g/mL,测定波长：,660nm,1、Lowry法Foling-酚法,反响(fnyng)原理：,第四页，共十五页。,测定步骤(bzhu)：标准蛋白BSA 250g/mL,1依次向试管中参加试剂：,2A660Pr作图，求待测蛋白(dnbi)浓度,管号,1,2,3,4,5,6,待测,1,待测,1,，,BSA(mL),0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.0,1.0,D.W(mL),1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0,0,0,Pr(g/mL),试剂甲（,mL,）,5.0,室温反应,10,分钟（双缩脲反应）,试剂乙（,mL,）,0.5,立即振摇，,30,水浴,20,分钟,A660,第五页，共十五页。,原理：蛋白质分子中Tyr,Try,Phe的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有UV吸收(xshu)的性质，吸收(xshu)顶峰在280nm处。,测定范围：0.11mg/mLpr,测定波长：280nm,标准蛋白BSA：1mg/mL,测定步骤：,1向各试管中依次参加各种试剂：,2以A280nm-Pr作标准曲线，求待测蛋白(dnbi)浓度,管号,1,2,3,4,5,6,待测,1,待测,1,，,BSA,（,mL,）,0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,4.0,4.0,D.W(mL),4.0,3.5,3.0,2.0,1.0,0,0,0,Pr(mg/mL),A280nm,2、紫外线UV吸收(xshu)法：,第六页，共十五页。,3、考马斯亮蓝显色(xin s)法Bradford法,实验原理：PrCBBG-250-Pr复合物 A595,标准蛋白(dnbi)BSA：250g/mL,操作步骤：,1依次向各试管中参加各种试剂：,2以A595nm-Pr作标准曲线，求待测蛋白(dnbi)浓度,管号,1,2,3,4,5,6,待测,1,待测,1,，,BSA,（,mL,）,0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.0,1.0,D.W(mL),1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0,0,0,Pr(g/mL),CBBG-250,（,mL,）,5.0,A595nm,第七页，共十五页。,蔗糖,(zhtng),酶,km,值的测定,第八页，共十五页。,一、实验目的：,掌握sucrose酶的km测定的实验方法。,二、实验原理：,蔗糖酶是一种水解酶，催化反响：蔗糖+水G+F,每水解1molS，生成2mol复原(hun yun)糖，因此可用比色皿测定复原(hun yun)糖量，即可知底物的水解速度。复原(hun yun)糖可复原(hun yun)3，5-二硝基水杨酸DNS生成红棕色的氨基化合物，即3-氨基-5-硝基水杨酸。,第九页，共十五页。,三、实验,(shyn),步骤,管号,蔗糖,（,ml,）,H,2,O,（,ml,）,1,2,3,4,5,6,7,8,0.5,0.75,1,1.5,2,2.5,3,4,4.5,4.25,4,3.5,3,2.5,2,1,每管加酶液,0.5 ml,37,准确作用,(zuyng),5 min,NaOH 0.5 ml,每管取,0.5ml,DNS 0.5ml,沸水浴,3min,冷却,DW 4ml,A520,取8只试管，按下表分别参加如下(rxi)试剂：,以,1/A,520,1/S,作图，求,Km,第十页，共十五页。,四、Km测定的意义:,1、酶的特征性常数，进行酶学研究必须测定的一个参数；,2、代谢研究特别(tbi)是分支代谢途径的调节，Km代表E争夺S的能力，对反响速度代谢的计算非常重要。,五、本卷须知：,1、底物浓度应选择在Km值附近；,2、反响时间应尽可能短，以保证反响初速度；,3、酶活力不能太高，否那么不易控制；,4、加样应为一个人操作，保证各管间隔一致。,第十一页，共十五页。,DNS-aa,的聚酰胺薄膜层析,(cn x),第十二页，共十五页。,一、实验原理：,荧光试剂二甲氨基萘磺酰氨DNS-Cl,能与氨基酸的N末端结合生成荧光物质(wzh)DNS-aa，DNS-Cl也可与多肽或蛋白质的游离氨基结合，生成DNA-Pr或DNS-肽，经酸水解后释放出DNS-aa，各种DNS-aa在聚酰胺薄膜的分配系数不一样，DNS-aa在360或280nm紫外光下发黄色荧光。,二、实验(shyn)步骤：,1、取聚酰胺薄膜1张一人一张，铅笔做上样点标记,2、上样，毛细管上样直径2mm，屡次上样,3、展层通风橱内,4、检测，用吹风机吹干，紫外光检测,第十三页，共十五页。,实验错开做，以防止仪器和试剂使用拥挤！,DNA提取实验放在第一或第二个做,分光光度计和水浴锅已调好，请不要(byo)调动波长和温度，比色皿专用，请勿混用。,实验报告,第十四页，共十五页。,内容,(nirng),总结,1、0.1g 细胞 2ml epp，混匀。1、0.1g 细胞 2ml epp，混匀。7、自然凉干10m，30lTE，充分溶解。标准蛋白BSA 250g/mL。测定步骤：标准蛋白BSA 250g/mL。2A660Pr作图，求待测蛋白浓度。5.0 室温反响10分钟双缩脲反响。3、考马斯亮蓝显色法Bradford法。掌握(zhngw)sucrose酶的km测定的实验方法。NaOH 0.5 ml,第十五页，共十五页。,