细胞凋亡

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞凋亡,妙通（上海）生物科技有限公司,技术部,曹磊,细胞凋亡概念,人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，近年来已成为生物学、医学研究的一个热点，到目前为此，人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡（,apoptosis）。,细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是近年逐渐被认识的一种细胞死亡方式。,细胞凋亡是指由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。,细胞凋亡是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。,细胞坏死,一般过程：因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。,特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释放酶，细胞核内染色质沉淀靠近核膜边，蛋白质合成下降，由于膜破裂，出现炎症反应。,细胞凋亡与坏死的区别,死亡,凋亡,1.,性质,2.,诱导因素,3.,生化特点,4.,形态变化,5.,炎症反应,6.DNA,电泳,7.,凋亡小体,8.,基因调控,病理性、非特异性,生理性或病理性、特异性,强烈刺激，随机发生,较弱刺激，非随机发生,被动过程，无新蛋白合成，不耗能,主动过程，有新蛋白合成，耗能,细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀,胞膜及细胞器相对完整，细胞皱缩，核固缩,溶酶体破裂，局部炎症反应,溶酶体相对完整，局部无炎症反应,弥散性降解，电泳呈均一,DNA,片状,DNA,片段化（,180-200bp,），电泳呈“梯”状条带,无,有,无,有,细胞凋亡的生理意义,确保正常发育、生长；,维持内环境稳定；,发挥积极的防御功能。,可见，细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。,凋亡与疾病,细胞凋亡与疾病的关系,该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生。,细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病。,细胞凋亡过度：心肌缺血，心里衰竭，神经元退行性疾病，病毒感染。,不足与过度并存：动脉粥样硬化。,凋亡过程,凋亡信号转导,凋亡基因激活,凋亡的执行,凋亡细胞的清除,凋亡时细胞的主要变化,生化特征：,胞浆内,Ca,2+,浓度升高。,细胞内活性氧增多。,质膜通透性变大。,DNA,内切酶活性被激活升高，双链,DNA,在核小体之间切断形成,180-200bp,整数倍的有序片段。,型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶活性升高。,凋亡的调控,凋亡相关因素,凋亡信号的转导,凋亡相关基因,凋亡相关因素：,诱导性因素：,激素和生长因子失衡,理化因素（高温、强酸、强碱、抗癌药物）,免疫性因素,微生物学因素（细菌、病毒）,抑制性因素：,细胞因子：,IL-2,，神经生长因子,某些激素,某些二价金属阳离子、药物,凋亡信号的转导：,1,、胞内,Ca,2+,在细胞凋亡中充当了传递凋亡信号的角色；胞内,Ca,2+,浓度上升可激活,Ca,2+,依赖的谷氨酰胺酶，活化核转录因子等触发细胞凋亡。,2,、,Camp/PKA,信号系统,3,、,Fas,蛋白,/Fas,配体信号系统,4,、神经酰胺信号系统,5,、二酰甘油,/PKC,信号系统,6,、酪氨酸蛋白激酶信号系统负调控作用,凋亡相关基因：,抑制凋亡基因：,Bcl-2,，,EIB,，,IAP,促进凋亡基因：,wtP53,，,Bax,，,ICE,双向调控基因：,c-myc,，,Bcl-x,凋亡检测,细胞凋亡的形态学检测,DNA,凝胶电泳,三,ELISA,核小体测定,四 流式细胞仪定量分析,一 细胞凋亡的形态学检测,光学显微镜和倒置显微镜：,染色细胞常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。,荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜：,常用的为,DNA,特异性燃料，有：,HO 33342,HO33258,DAPI,，三种染料与,DNA,的结合是非嵌入式的，主要结合在,DNA,的,A-T,碱基区。,3,透射电子显微镜观察。,二,DNA,凝胶电泳,检测原理：,细胞发生凋亡或坏死，其细胞,DNA,均发生断裂，细胞内小分子量,DNA,片段增加，高分子,DNA,减少，胞质内出现,DNA,片段。但凋亡细胞,DNA,断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现,180-200bp,整数倍的,DNA,片段，而坏死细胞的,DNA,断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。,三,ELISA,核小体测定,凋亡细胞的,DNA,断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的,DNA,片段组成，可由,ELISA,法检测。,步骤：,1,、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；,2,、在微定量板上媳妇组蛋白体；,3,、加上清液使组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合；,4,、加辣过氧化物酶标记的抗,DNA,抗体使之与核小体上的,DNA,结合；,5,、加酶的底物，测光吸收制。,四 流式细胞仪定量分析,检测原理：,细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光前度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。,检测形态学及细胞膜完整性的,Hoechs-PI,双染色法。,利用,Hoechs-PI,染色法，正常细胞对燃料有抗拒性，荧光染色很浅；凋亡细胞主要摄取,Hoechs,染料，呈现强蓝色荧光；而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（,PI,）而呈强的红色荧光。,DNA,片段原位标记法,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸和末端脱氧核苷酸转移酶（,TdT,）相反应与凋亡细胞裂解后,3,的羟基（,-OH,）端结合，经显色反应后检测,DNA,裂解点的技术。,DNA,片段原位标记法有两种：,原位缺口转移（,ISNT,）技术,原位缺口末端标记技术，即,TUNEL,法。,检测细胞膜成份变化的,Annexin V,联合,PI,法,原理：,在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（,PS,）迁移至细胞膜外侧。磷脂结合蛋白,V,（,Annexin V,）是钙依赖性的磷脂结合蛋白，它与,PS,具有高度的结合力。因此,Annexin V,可以作为探针检测暴露在细胞外侧的,PS,。故利用对,PS,有高度亲和力的,Annexin V,，将,Annexin V,标记上荧光素，同时结合使用,PI,拒染法进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。,结果判断：正常活细胞,Annexin V,、,PI,均低染；凋亡细胞,Annexin V,高染、,PI,低染；坏死细胞,Annexin V,、,PI,均高染。,Annexin V,联合,PI,法更加省时，结果更为可靠，是最为理想的检测细胞凋亡的方法。,THAT S ALL,THANK YOU!,