第09章干细胞术

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章 干细胞技术,1967,年，多纳尔,托马斯报道，如果将正常人的骨髓移植到病人体内，可以治疗造血功能障碍。,1970,年，小鼠胚胎干细胞在体外培养获得成功。,1999,年，,Margarel Goodell,发现，小鼠肌肉组织干细胞可以“横向分化”成血液细胞，人成体干细胞同样具有“横向分化”的功能。,第一节 干细胞概述,干细胞,（,stem cells,）是一类,未分化的或原始的、具有自我更新能力,（,self-renewing,）的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成机体内的多功能细胞，形成任何类型的组织和器官，以实现机体内部构建和自我康复能力。,干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。,目前，人类,胚胎干细胞,可成功地在体外培养，,成体干细胞,可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的应用奠定了基础。,一、干细胞的分类与来源,（一）干细胞的分类,1,按照生存阶段分类,干细胞可分为胚胎干细胞（,ESC,）和成体干细胞（,ASC,）。,胚胎干细胞包括胚胎干细胞和胚胎生殖细胞（,EGC,）。,成体干细胞包括骨髓间充质干细胞（,MSC,）、血液干细胞（,HSC,）、表皮干细胞和神经干细胞（,NSC,）等。,2,按分化潜能分类,干细胞可分为全能干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞和单能干细胞,（,1,）全能干细胞：,具有,形成完整个体,的分化潜能。如,胚胎干细胞,，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身,200,多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官，最终发育成一个完整的个体。,受精卵,就是一个最初始的全能干细胞。,（,2,）多能干细胞：,具有,分化出多种细胞组织,的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。,骨髓多能造血干细胞,是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。,（,3,）单能干细胞：,也称专能、偏能或定向干细胞，只能,向一种类型,或密切相关的两种类型的细胞分化，如,上皮组织基底层的干细胞,，肌肉中的成肌细胞或卫星细胞。,（二）干细胞的来源,1,胚胎干细胞,可来源于畸胎瘤细胞、桑椹球细胞、囊胚内细胞团、拟胚体细胞、生殖原基细胞等。,ESC,是在人胚胎发育早期,囊胚（受精后,57d,）中未分化的细胞。,囊胚含有约,140,个细胞，,外表,是一层扁平细胞，称,滋养层,，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。,中心,的腔称,囊胚腔,，腔内一侧的细胞群，称,内细胞群，这些未分化的细胞可进一步分裂、分化，发育成个体。,将内细胞团分离出来进行培养，在一定条件下，这些细胞可在体外“无限期”地增殖传代，同时还保持其全能性，因此被称为,ESC,。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。,2,成体干细胞,成年动物的许多组织和器官，比如,表皮和造血,系统，具有修复和再生的能力。在特定条件下，,成体干细胞,或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。,成体干细胞可以由下列几个方面得到：,胚胎细胞,由,ESC,定向分化或移植分化而成。,胚胎组织,由分离胚胎组织、细胞分离或培养而成。,成体组织,由脐血、骨髓、外周血、骨髓间质和脂肪细胞等得到。,二、干细胞的应用研究,1,胚胎干细胞育出心脏组织,以色列,科学家从胚胎干细胞培养出的人类心脏组织，可以自然跳动，并且有新生心脏组织的电特性和机械性。实验证明，以细胞移植治疗心脏病是可能的。德国医生使用病人自身的干细胞治疗心肌梗塞取得了可喜的成果。,2,骨髓干细胞育出肾脏组织,英国科学家,用骨髓干细胞培育出了肾脏组织，这在器官移植手术中是一个重大突破，医生可通过修补受损肾脏达到治疗的目的。同时，也证明了成人骨髓干细胞可以发育成成熟的肾脏细胞。,3,脐血干细胞,由干脐带血和胎盘含有大量的干细胞，因而受到越来越多的重视和利用。,1979,年，医学界首次发现脐带血中含有恢复白血病患者造血功能的细胞。自,1998,年以来，从胎盘和脐带血中提取出来的血液，已挽救了数百人的生命。,4,皮肤干细胞,我国研究人员发现，人体烧伤皮肤原位处存在着皮肤干细胞，利用它在一定药剂调控下，能使烧伤的皮肤原位再生，修复如初。这是我国在皮肤干细胞研究及其临床应用上的重大突破。,5,胰岛干细胞,美国,Ramiya,等从尚未发病的糖尿病小鼠胰岛导管中分离出胰岛干细胞，在体外诱导分化成产生胰岛素的,细胞。实验表明，接受移植的糖尿病鼠血糖浓度控制良好，而对照组小鼠死于糖尿病，为干细胞治疗糖尿病奠定了实验基础。,6,神经干细胞,由于分离神经干细胞所需的胎儿脑组织较难取材，加之胚胎细胞研究尚存在争议，神经干细胞的研究仍处于初级阶段。脑和脊髓由于血脑屏障的存在，使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应，如给帕金森综合症患者的脑内移植含有多巴胺生成细胞的神经干细胞，可缓解部分患者症状。,三、干细胞应用平台技术,1,技术原理,细胞分化过程中，往往由于高度分化而完全失去再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了祢补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，称为干细胞。一旦生理需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞，即干细胞充当了分化细胞“预备队”的角色。在动物体内，多数组织含有干细胞，甚至在进化的早期，最初级的后生动物,海绵也含有称之为“始祖母细胞”的干细胞。,（,1,）干细胞的特点：,干,细胞本身不是处于分化途径的终端。,干细胞能无限的增殖分裂。,干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。,（,2,）干细胞的分裂方式：,一是对称分裂,，形成两个相同的干细胞。,二是非对称分裂，,由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。可以说，干细胞是具有多潜能和自我更新特点的、增殖速度较缓慢的细胞。,2,技术方向,凡需要不断产生新的分化细胞和分化细胞本身不能再分裂的细胞或组织，都要通过干细胞所产生的具有分化能力的细胞来维持机体细胞的数量。,生命体是通过干细胞的分裂，实现细胞的更新而保证持续生长。,随着基因工程、胚胎工程、细胞工程等生物技术的发展，按照一定的目的，在体外人工分离、培养干细胞已成为可能，利用干细胞构建各种细胞、组织、器官作为移植器官的来源，将成为干细胞应用的主要方向。,3,技术突破,一是人类胚胎干细胞在体外培养成功,。,1998,年，,James Thomson,和,John Gearhart,从人囊胚的内层细胞团中取得胚胎干细胞，将胚胎干细胞与小鼠的骨髓间质细胞进行共培养，结果表明胚胎干细胞可以进行长达,5,个月的非分化增殖，同时还保持着分化为滋养层组织及三种胚层组织的能力，为胚胎干细胞的应用奠定了基础。,另一个重大突破是成体干细胞的横向分化,。,1999,年，,Goodell,等用肌肉来源的干细胞在小鼠体内分化成各种血细胞，这表明成体干细胞在一定的微环境作用下，可以横向分化为需要的细胞和组织，从而起到极为有效的治疗作用。,4,干细胞的分离与纯化,体外干细胞分离的方法，首先是从已被证明含有干细胞的胚胎或成年哺乳动物的器官中取材，然后将所取的组织进行解离分散，最后将已分离的细胞暴露于含有高浓度促细胞分裂剂的培养基中，经过一定数量的增殖后，撤消促细胞分裂剂而诱导细胞进行分化（如向神经元方向分化），或把细胞暴露于其它因子中使其中的一些细胞发育为不同的细胞系。,5,干细胞的体外培养,由于干细胞的数目很少，需要在体外对干细胞进行非分化性增殖。这需要许多生长因子和间质细胞的共培养。,Brustle,等在体外成功地培养了鼠的,表皮干细胞,，首先把分离的,表皮干细胞,在含有成纤维细胞因子,2,（,FGF-2,）的培养基中培养，随后加入上皮生长因子（,EGF,），最后在,FGF-2,和血小板源性生长因子（,PDGF,）的混合培养基中生长增殖。在这种培养条件下，,表皮干细胞,可以保持其分化潜能，如停止供给生长因子，,表皮干细胞,会分化为寡树突细胞或星状细胞。不同组织来源的干细胞的培养条件不尽相同。在应用前还需依据靶组织类型对培养干细胞进行定向分化诱导。准确的分化诱导是应用干细胞治疗的基础，这需要对与干细胞发育有关的信号调节及微环境的影响进行详细研究,第二节 胚胎干细胞,胚胎干细胞（,ESC,）是在人胚胎发育早期,囊胚（受精后,57d,）中未分化的细胞。囊胚含有约,140,个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称,内细胞群，,这些未分化的细胞可进一步分裂、分化，发育成个体。,内细胞群在形成内、中、外三个胚层时开始分化。,每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官。如,外胚层,将分化为皮肤、眼睛和神经系统等，,中胚层,将形成骨骼、血液和肌肉等组织，,内胚层,将分化为肝、肺和肠等。由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。当内细胞群在培养皿中培养时，称为,ESC,。,第三节 成体干细胞,越来越多的证据表明，,ASC,被移植入受体中能表现出很强的可塑性。通常情况下，供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。而在某些情况下，干细胞的分化并不遵循这种规律。,1999,年，,Goodell,等分离出小鼠的,肌肉干细胞,，体外培养后，,与少量的骨髓间质细胞,一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现,肌肉干细胞会分化为各种血细胞系,，这种现象被称为干细胞的横向分化。以造血干细胞为例加以说明。,造血干细胞,(HSC),是体内各种血细胞的唯一来源，,它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。造血系统是体内高度活跃和高度新陈代谢系统，,HSC,的基本特征是自我维持和自我更新,，,即通过不对称性有丝分裂，在不断产生大量祖细胞的同时，使自己不增殖也不分化。,由,HSC,到祖细胞再到外周血细胞的分化调节过程相当复杂，依赖于各种造血生长因子、造血基质细胞、细胞外基质等多种因素的相互作用与平衡，并涉及细胞的增殖分化、发育成熟、迁移定居、衰老凋亡和癌变等生命科学中的许多基本问题，这也是基础研究的主要热点。,1,造血干细胞的特点,首先，,在个体发育过程中，,HSC,历经多次迁移，先由卵黄囊转移到胎肝，最后到达骨髓，其后的某些条件下又可出现髓外造血的情况；而其它多能干细胞多在固定的场所发育成特定的组织。,其次，,由于生理需要，,HSC,始终处于较为活跃的增殖与分化状态，能从骨髓源源不断地进入外周血而到达全身各处，而成熟个体中的多能干细胞多局限于相应的组织器官中，一般情况下处于类似休眠的状态。,第三，,造血干细胞具有可塑性，可以分化为肝脏、肌肉及神经等组织的细胞，一定条件下又可来源于肌肉干细胞、神经干细胞等。,2,骨髓库,在临床治疗中，,HSC,应用较早，,HSC,移植就是应用超大剂量化疗和放疗以最大限度杀灭患者体内的白血病细胞，同时全面催毁其免疫和造血功能，然后将正常人的,HSC,输入患者体内，重建造血和免疫功能，达到治疗疾病的目的。但是，造血干细胞移植需先进行人白细胞抗原（,HLA,）配型。,HLA,是人体细胞表面的“主要组织相容性复合物”，只有两个个体,HLA,配型相同，才能进行,HSC,移植，否则会发生移植物抗宿主反应（,GVHD,）或移植排斥反应，严重者可危及患者生命。,HLA,由遗传决定，理论上说，每五个同胞兄弟姐妹中可能有,2,人的,HLA,抗原完全相合，而在无血缘关系的人群中，约,10,万人以上才可能有两个,HLA,完全相同的个体。鉴于我国国情，在年轻患者的同胞中寻找,HLA,相合供体的可能性极小,由于,HSC,具有自我复制功能，捐赠骨髓一般不影响健康。