DNA重组的载体蓝背景

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level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,DNA重组的载体蓝背景,载体的功能及特征,载体的功能P12,为外源基因提供进入受体细胞的转移能力,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因提供在受体细胞中 扩增和表达能力,注意,:上述三大功能并非所有的载体分子都必须具备,载体的功能及特征,载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性可转移性,具有适宜的筛选标记,具有较,高的外源,DNA,的载装能力,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,质粒载体,质粒的根本特征,定义:质粒是一类存在于原核细菌和真菌细胞中,能独立于寄主染色体而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子并被稳定遗传的一类核酸分子。是处于生命与非生命的分界限上。,1质粒常见于原核细菌和真菌中;,2绝大多数的质粒是DNA型的,绝大多数的天然DNA质粒具有共价封闭、环状的分子构造,即cccDNA;,3质粒DNA的分子量范围:1-100 kb,质粒的根本特征,1.,质粒的自主复制性:,质粒能摆脱寄主细胞的DNA复制系统的束缚进展自主复制;,质粒DNA上含有自己的复制起始区ori,形成独立的复制子构造,根据在每个细胞中的分子数拷贝数多寡,质粒可分为两大复制,类型:,严紧型复制控制的质粒 1-,5,拷贝,stringent plasmid,松弛型复制控制的质粒,30,-,5,0 拷贝,relaxed plasmid,质粒的根本特征,2.,质粒的可转移性:,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类:,接合型质粒,:能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个,细胞接合作用,如F、Col、R质粒等;,非接合型质粒,:不能在天然条件下独立地发生接合作用。,值得注意的是,某些非接合型质粒ColE1在接合型质粒的存在,和协助下,也能发生,DNA,转移,这个过程由,bom,和,mob,基因决定。,质粒的根本特征,3.,质粒的不相容性:,任何两种含有相似复制子构造的不同质粒,不能同时存在于一个,细胞中,这种现象称为质粒的,不相容性,,不相容性的质粒组成,不,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子构造,彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子构造,彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子构造,彼此不相容,相容性群,。以大肠杆菌的质粒为例:,质粒的根本特征,4.,携带特殊的遗传标记:,野生型的质粒,DNA,上往往携带一个或多个遗传标记基因,这,使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状,包括:,物质抗性,抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成,抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对,DNA,重组分子的筛选具有重要意义。,质粒的构建,原因:天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少遗传标记不理想等缺陷,不能满足克隆载体的要求,因此往往需要以多种野生型质粒为根底进展人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大,多是由少数几个野生型质粒构建而成的:,pSC101,8.8 kb,,拷贝数 5,四环素抗性标记基因,Tc,r,ColE1,6.5 kb,,拷贝数 20,-30,,大肠杆菌内毒素标记基因,E1,RSF2124,ColE1,衍生质粒,氨苄青霉素抗性标记基因,Ap,r,改造的原那么,1删除不必要的DNA区域,尽量缩小质粒的相对分子质量,2灭活某些质粒的编码基因,应为非转移性质粒,应为松弛型质粒,3参加易于识别的选择标记基因,4引入具有多种限制性内切酶的单一识别位点,5根据外源基因克隆的不同要求,加装特殊的基因表达调控元件,构建过程P14,质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类:,高拷贝质粒,突变拷贝数控制基因,拷贝数1000-3000,扩增基因,低拷贝质粒,来自,pSC101,,拷贝数小于10,表达某些毒性基因,温敏质粒,在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker,整合质粒,装有整合促进基因及位点,便于外源基因的整合,穿梭质粒,装有针对两种不同受体的复制子,便于基因克隆,表达质粒,装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒,装有报告基因,便于启动子等元件的克隆筛选,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322:,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/,cell,用于基因克隆,pUC18,/19:,拷贝数 2000-3000/,cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点MCS,正选择颜色标记,lacZ,重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18,/19:,正选择标记,lacZ,的显色原理,pUC18,/19,Plac,lacZ,MCS,b,-,半乳糖苷酶的,a,-,肽段,a,b,5-,溴-4-氯-3-吲哚基-,b,-D-,半乳糖苷,X-gal,重要的大肠杆菌质粒载体,pGEM-3Z,:,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点MCS,正选择颜色标记,lacZ,用于外源基因的高效表达,注意:,T7,和,SP6,启动子特异性地由噬菌体,DNA,编码的,RNA,聚合,2743 bp,MCS,lacZ,P,T7,ori,Ap,r,pGEM-3E,P,SP6,酶所识别,因此相应的受体菌必须表达噬菌体,RNA,聚合酶,如:,BL21DE3等,质粒DNA的别离纯化,实验室一般使用以下三种方法制备质粒DNA:,氯化铯密度梯度离心法,质粒,DNA,纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱溶法,质粒,DNA,纯度底、快速、操作简便,沸水浴法,质粒,DNA,纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,氯化铯密度梯度离心法:,用含有,EDTA,的缓冲液悬浮菌体;,加溶菌酶裂解细菌细胞壁;,加,CsCl,和溴乙锭;,超速离心过夜;,在紫外灯下吸取,cccDNA,;,稀释沉淀,cccDNA,。,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,碱溶法:,用含有,EDTA,的缓冲液悬浮菌体;,加溶菌酶裂解细菌细胞壁;,加,NaOH,和,SDS,的混合溶液,破膜释放内含物;,加高浓度的醋酸钾溶液,沉淀染色体,去除染,色体DNA及大局部蛋白质;,离心取上清液,用苯酚-氯仿萃取,去除痕量的蛋白质;,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒,DNA,;,用无DNase的RNase去除剩余的RNA。,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,沸水浴法:,用含有,EDTA,和,Triton X-100,的,加溶菌酶裂解细菌细胞壁;,沸水浴40秒钟;,离心,用无菌牙签挑去沉淀物;,乙醇或异丙醇沉淀质粒,DNA,。,缓冲液悬浮菌体;,另一类载体,噬菌体或病毒,DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物,能高效率高
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