细胞生物学实验技术

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第三章 细胞生物学研究方法,Preparatory observe,put forward theoretics,Design control tests,Collect data,Explain results,Devise conclusion,Refer to knowledge,How cells are studied,你要脚踏实地从事研究并如实报告观察结果；同时也要保持健康长寿。,1983,年,McClintock B.,才,获得诺贝尔生理医学奖。,你也有可能获诺贝尔奖,1938,年提出“转座子”概念；,1944-1950,年提出,D,S,A,C,调控系统（玉米籽粒或叶片色泽调控系统：,C,D,S,A,C,）；,1951,年提出“跳跃基因”学说。,1965,年诺贝尔获奖者为提出与,D,S,A,C,调控系统非常相似的大肠杆菌,乳糖操纵子模型,的和。,1976,年在冷泉港召开的“,DNA,插入因子、质粒和游离基因”专题讨论会上，她才是基因调控“操纵子理论”的先驱。,Fluorescein,The location of DNA and proteins within the same cell.,DNAblue,Tubulingreen,Actinred,Golgiyellow,Mitochondriapurple,Techniques in Cell Biology,第一节,细胞形态结构的观察方法,（细胞水平,光镜和电镜）,第二节,细胞组分的分析方法,（分子水平,细胞组分分离与纯化）,第三节,细胞培养、细胞工程与显微操作技术,（研究工具,基因表达与表观遗传）,第四节,用于细胞生物学研究的模式生物,（细胞是生命的基本单位）,第一节 细胞形态结构的观察方法,普通光镜,特殊光镜,形态观察,扫描式电子显微镜,扫描隧道电子显微镜,透射式电子显微镜,冰冻蚀刻技术,紫外光显微镜,暗视野显微镜,相差显微镜,微分干涉差显微镜,荧光显微镜,激光共聚焦显微镜,光学显微镜,电子显微镜,光学显微镜的分辨率与放大倍数：,物像是否清楚,不在于放大倍数的多少，而是决定于显微镜的分辨率,（,resolution,）,大小,。,即能够清楚区分两个质点之间的最小距离，称为分辨率,。,第一节 细胞形态结构的观察方法,显微镜是观察细胞的主要工具,人眼,光学显微镜（可见光、紫外光）,。细胞核、线粒体、核仁和染色体的直径大于的显微结构。,电子显微镜（电子束）,。病毒核糖体、球形蛋白、小分子、内质网膜、核膜、微管、微丝等小于的亚显微结构。,第一节 细胞形态结构的观察方法,分辨率公式,波长,可见光,760-380nm,紫外光,380-180nm,x,射线,电子束,(1,万伏,) 0.0122nm,第一节 细胞形态结构的观察方法,NA,nsin,（,/2,）,n=,介质的折射率；,=,镜口角：,标本对物镜镜口的张角，,140,。,数值孔径,（,numeric aperture,）,与镜口角（,）的关系,第一节 细胞形态结构的观察方法,放大倍数,=,显微镜的分辨率,人肉眼的分辨率,0.2,m,可见紫外光源波长,(nm),限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长，一般光学显微镜的最大放大倍数为,10001500,。,小于,m,的一些细微结构，称为亚显微结构,(submicroscopic structure),或超微结构,(ultrastructure),，在光学显微镜下无法看清。,要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。,第一节 细胞形态结构的观察方法,目镜,物镜,聚光器,载物台,光源,结构组成,:,（一）普通光学显微镜,照明系统（光源、聚光器）,光学放大系统（物镜、目镜）,机械装置（载物台）,第一节 细胞形态结构的观察方法,2,图像,样品,光线,聚光器,物镜,光学显微镜的光路图,第一节 细胞形态结构的观察方法,移动臂,蜡或树脂包埋的样品,切片用钢刀,样品切片蜡带,伸展在盖玻片和,载玻片之间的切片,切片机,(microtome),第一节 细胞形态结构的观察方法,细胞厚度一般有,20,30m,，无法看清楚一个完整的一个细胞。标本制备：包括固定、包埋、切片、脱蜡和染色过程,细胞结构呈,半透明状,，不易看清（原因是什么），,往往将标本切片进行染色,，提高可辨程度,。,第一节 细胞形态结构的观察方法,染色的成像原理,1.,紫外光显微镜,光源为波长介于,180nm-380nm,之间，分辨率可提高,1,倍，可见到普通光镜看不见的胶体颗粒。,细胞中的核酸和一些蛋白质可吸收一定波长的紫外线，因而可测定细胞核中的核酸含量。,（二）特殊光学显微镜,因紫外线不易穿透普通玻璃，只能用造价高的石英、萤石、碳酸锂等特殊材料制作透镜，故,实用性较差,。,第一节 细胞形态结构的观察方法,2.,暗视野显微镜,光线不能直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜 。能见小于,4200nm,的微粒子，如核、线粒体清晰可见，分辨率比普通光镜提高,50X,。,中央遮光板,第一节 细胞形态结构的观察方法,视野的背景,黑,物体的边缘,亮,聚光器的设计原理：,第一节 细胞形态结构的观察方法,暗视野显微镜,光路图,第一节 细胞形态结构的观察方法,明,暗,视,场,第一节 细胞形态结构的观察方法,3 .,相差显微镜,1953,年获诺贝尔物理奖,1935,年，荷兰物理学家,F. Zernike,研制发明，提高了活细胞结构的反差，从而解决了对活细胞观察的难题。,因活细胞和未染色的细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化（振幅差），人眼无法观察。而相差显微镜通过改变相位差为振幅差，和普通显微镜的区别是：用环状光阑代替,可变光阑,，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的,望远镜,。,第一节 细胞形态结构的观察方法,1应用范围,观察未经染色的活细胞、细胞核、线粒体,介壳虫染色体,The image of a fibroblast in culture by Four types of light microscopy,(A),bright-field microscopy,（普通光镜）,(B) phase-contrast microscopy,（相差镜）,(C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy,（诺马斯基微分干涉差显微镜）,(D) dark-field microscopy,（暗视野显微镜）,第一节 细胞形态结构的观察方法,观察未经染色的玻片标本,第一节 细胞形态结构的观察方法,基本原理,相 位,：,某一时间振动点在振动周期中的位置。,相位差,：,两束光波在同一时间的相位差距。,（,1,）相位和相位差,第一节 细胞形态结构的观察方法,（2）相干波的相位差与振幅的关系,当两束波的相位差等于零（或等于,的整数倍时），其合成波的振幅为两束波振幅之和,相长干涉,。,振幅,A3=A1+A2,，亮度加强。,当两束相干波,1,、,2,相遇时可能发生干涉形成合成波,3,当两束波的相位差为,/2,时，合成波振幅为两波振幅之差,相消干涉,。,振幅,A3=A1-A2,，亮度减弱。,第一节 细胞形态结构的观察方法,（3）相差显微镜的工作原理,光通过密度大的物质时，光的滞留时间长，密度小的滞留时间短。,相差显微镜,可将这种光程差或相位差转换成振幅差，从而使标本密度不同的区域转换成亮度明暗的差异。从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。,第一节 细胞形态结构的观察方法,光线透过标本后发生衍射，偏离了原来的光路，同时波长被延迟了1/4;,如果再增加或减少1/4，则光程差变为0或1/2，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减小，增强反差。,第一节 细胞形态结构的观察方法,相差显微镜有2个特殊构造,1. 环形光阑,annular diaphragm,2. 相位板,annular phase plate,第一节 细胞形态结构的观察方法,上有一环形区，制成凹槽或凸起（亦可涂上特殊物质）：,环形区的设计深度（或高度）恰好可使通过此区的光线提前或延后,1/4,光程差。,环形光阑,环形相板,使透过聚光器的光线形成,空心光锥,，焦聚到标本上。,第一节 细胞形态结构的观察方法,相差显微镜,的光路图解,根据设计：,只有未透过标本的直射光可通过相板环形区，而透过标本的偏折光则由相板其它部分通过。,两组光线和轴后发生干涉现象。,第一节 细胞形态结构的观察方法,S+D,S,D,凸形相板,-1/4,+1/4,两组光波相加，振幅加大，形成,亮反差,（负反差）,标本结构比周围介质更加变亮。,直射光,衍射光,第一节 细胞形态结构的观察方法,S-D,S,D,凹形相板,通过样品的光线延后,1/4,-1/4,-1/4,两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成,暗反差,（正反差）,结构比周围介质更加变暗。,第一节 细胞形态结构的观察方法,4.,微分干涉差（,DIC,）显微镜,DIC,显微镜是,Nomarski (1952),在相差显微镜原理的基础上发明的，又称,Nomarski,相差显微镜，其优点是,能显示三维立体结构的投影影像,。,第一节 细胞形态结构的观察方法,DIC显微镜的应用,1.,标本可略厚一点，折射率差别更大。,2.,适合于如核、线粒体等立体感特别强的细胞器的,显微操作,。,3.,基因注入、核移植、转基因等的,显微操作,。,第一节 细胞形态结构的观察方法,计算机辅助DIC显微镜,Extending the limits of detection.,Light-microscope images of unstained microtubules that have been visualized by differential-interference-contrast microscopy followed by electronic image processing.,The original unprocessed image.,(B) The final result of an electronic process that greatly enhances contrast and reduces noise.,（,Electronic image processing,）,第一节 细胞形态结构的观察方法,观察微管上颗粒的运动,情况,Observing living specimens Greatly increase the contrast of an image so that very small objects become visible,录像增差显微镜技术,（,Video-enhance contrast microscopy,第一节 细胞形态结构的观察方法,BF,DIC,RC,光镜下的,7,种观察方式,PH,DF,FL,POL,第一节 细胞形态结构的观察方法,5. 荧光显微镜,利用较短波长的光使标本受到激发产生较长波长的荧光成像而被观察到。观察和分辨标本中某些物质的分布、性质和数量的显微镜。,是目前在光镜水平上对特异蛋白质等生物大分子定性定位研究的最有力工具之一。,第一节 细胞形态结构的观察方法,A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic (beam-splitting) mirror (2). In this example the filter set for detection of the fluorescent molecule fluorescein is shown.,光学原理,第一节 细胞形态结构的观察方法,第一节 细胞形态结构的观察方法,自发荧光,（物质分子本身）,叶绿素+UV 红色荧光,纤维素+UV 黄色荧光,间接荧光,（物质分子+荧光染料）,酸性品红、吖啶橙、甲基绿、刚果红)+UV 荧光,如：RNA+吖啶橙 橙色荧光,DNA +吖啶橙 绿色荧光,荧光的发生,第一节 细胞形态结构的观察方法,荧光染料（Fluorescent dyes）,The structures of fluorescein isothiocyanate,（,FITC,异硫氰酸荧光素,）,and tetramethyl rhodamine isothiocyanate,（,TRITC，四甲基异硫氰酸罗丹明,）, two dyes that are commonly used for fluorescence microscopy. FITC emits,green light, whereas the TRITC emits red light.,第一节 细胞形态结构的观察方法,荧光探针:荧光素、荧光抗体,Tubulin,呈绿色、,Actin,红色、,Nuclei,蓝色,第一节 细胞形态结构的观察方法,分裂细胞的,免疫荧光图像,不同荧光染料,标记,抗 体,抗原,(,细胞的蛋白质成分,),特异性结合,荧光抗体,第一节 细胞形态结构的观察方法,第一节 细胞形态结构的观察方法,细胞壁,细胞膜,细胞核,细胞壁,细胞壁,细胞膜,细胞核,细胞膜,细胞核,A,细胞核,细胞膜,细胞壁,BB,细胞核,细胞膜,CB,转入,GFP,基因的烟草单细胞：,A,为转入,GFP,基因；,B,为转入,SCaM1-GFP,融合基因；,C,为转,SCaM4-GFP,融合基因。,细胞核和,GFP,定位,（录像）,荧光标记观察,LCSM Image of a,Xenopus Melanophore,microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue),第一节 细胞形态结构的观察方法,6.倒置显微镜(荧光相差),莱卡倒置显微镜,培养细胞的观察,第一节 细胞形态结构的观察方法,与普通显微镜组成同，但物镜（相差）在载物台之下，照明系统在,载物台之上。,7.激光扫描共聚焦显微境（laser scanning confocal microscope ，LSCM）,共焦：,扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。,由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的1.5倍。,第一节 细胞形态结构的观察方法,LSCM成像原理：,传统光镜使,用场光源,，标本上每一点的图像都会受到邻近点衍射或散射光的干扰。 LSCM利用激光束经照明针孔形成,点光源,对标本内焦平面的每一点扫描，在探测针孔处成像，再经光电倍增管逐点或线接收于计算机监视屏幕上形成荧光图像。,第一节 细胞形态结构的观察方法,用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。,系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的,立体结构,。,第一节 细胞形态结构的观察方法,Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy,These two micrographs are of the same intact gastrula-stage（原肠期）,Drosophila,embryo（果蝇） that has been stained with a fluorescent probe （荧光探针）for actin filaments（肌动蛋白微丝）. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo.,第一节 细胞形态结构的观察方法,4.,冰冻蚀刻技术,2.,扫描式电子显微镜（,SEM,）,3.,扫描隧道电子显微镜（,STM,）,1.,透射式电子显微镜（,TEM,）,二、电子显微镜,电镜问世的必然性,第一节 细胞形态结构的观察方法,各种光及电子束的波长,第一节 细胞形态结构的观察方法,利用高能量电子束轰击样品表面激发出各种物理信号，再利用不同的信号探测器接受物理信号转换成图象信息。鉴定微区域晶体结构、微细组织、化学成分、化学键和电子分布情况。,电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。,V,1,TEM,分辨率达到,第一节 细胞形态结构的观察方法,由于电子束不能透过玻璃，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有,m,（,50nm,）的,超薄切片,，并放在铜网上。,超薄切片,铜网,第一节 细胞形态结构的观察方法,步骤:,(1)固定：,通常以锇酸和,戊二醛固定样品,(2)脱水：,丙酮或乙醇,(3)包埋 ：,环氧树脂,(4)切片：,超薄切片机，切,片厚度2050nm,(5)染色：,切片采用重金属,盐染色，以增大反差,第一节 细胞形态结构的观察方法,负染色技术：,用重金属盐（如,磷钨酸钠、醋酸铀,）对铺展在载网上的样品进行染色。吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达左右。,可用于观察细胞内生物大分子，如微丝。,Electron micrograph of negatively stained actin filaments.,Each filament is about 8 nm in diameter and is seen, on close inspection, to be composed of a helical chain of globular actin molecules. (Courtesy of Roger Craig.),Negative Staining and Cryoelectron Microscopy Allow Macromolecules to Be Viewed at High Resolution,第一节 细胞形态结构的观察方法,电镜与光镜的主要区别,电 镜,光 镜,电子束,可见光,电磁透镜,玻璃透镜,电磁聚焦,机械聚焦,超薄切片,(0.05,m),石蜡切片,(110,m),光 源,透 镜,聚焦方式,切片厚度,图 像,彩色图像,黑白图像,第一节 细胞形态结构的观察方法,电镜与光镜的成像原理比较：,第一节 细胞形态结构的观察方法,1932,年,Ruska,在,Siemens,设计制造了世界上第一台以电子束为光源的透射电子显微镜,第一节 细胞形态结构的观察方法,TEM,（,transmission electron microscope,）,TEM的基本构造,（1）电子束照,明系统,（2）电磁透镜,成像系统,（3）真空系统,（4）记录系统,第一节 细胞形态结构的观察方法,TEM成像基本原理,与光学显微镜基本一样，所不同的是用,电子束,作,光源,，用,电磁场,作,透镜,。,利用样品对电子的透射和散射形成明暗反差。,第一节 细胞形态结构的观察方法,超薄切片技术的应用,1观察细胞内部或表面的超微结构。,第一节 细胞形态结构的观察方法,Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other heavy metal ions,The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen.,内质网透射电镜图（伪彩色）,第一节 细胞形态结构的观察方法,超薄切片技术的应用,2,超薄切片技术与放射自显影、细胞化学、,免疫电镜、电镜原位杂交等技术结合，用,于不同目的的研究。,第一节 细胞形态结构的观察方法,二磷酸腺苷(ADP)酶的定位,Electron micrograph of a cell showing the location of a particular enzyme,(nucleotide diphosphatase),in the Golgi apparatus,A thin section of the cell was incubated with a substrate that formed an electron-dense precipitate(,沉淀）,upon reaction with the enzyme,第一节 细胞形态结构的观察方法,Electron micrographs of an insulin-secreting cell in which the insulin,（胰岛素）,molecules have been labeled with anti-insulin antibodies bound to tiny colloidal gold,（胶体金）,spheres. Most of the insulin is stored in the dense cores,（密集核心）,of secretory vesicles,（分泌泡）,; in addition, some cores are being degraded in lysosomes,（溶酶体）,观察胰岛素分泌细胞,Immunogold electron microscopy,第一节 细胞形态结构的观察方法,扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM，）,工作原理：,电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品的表面结构有关，次级电子由探测器收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。,为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层金膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,第一节 细胞形态结构的观察方法,SEM可用来观察标本的表面结构,Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For comparison, the same structure is shown by differential-interference-contrast light microscopy (B) and by thin-section electron microscopy (C).,第一节 细胞形态结构的观察方法,SEM观察培养细胞的表面结构,Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish.,第一节 细胞形态结构的观察方法,第一节 细胞形态结构的观察方法,酵母细胞,精子,3.,扫描隧道显微镜,其关键部件是有一个加上一定电压的精密,探针,，当探针接近物质时，由于隧道效应而有电子飞出，从而在探针与物质之间有电流通过。,Binnig,、,Rohrer,等,(1981),发明。,荣获,1986,年物理学诺贝尔奖！,(scanning tunneling microscope, STM),探针,物质,第一节 细胞形态结构的观察方法,STM原理,当原子尺度的针尖在不到1nm的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一低电压（2mV2V），针尖与样品之间产生隧道效应，而有电子逸出，形成隧道电流。,电流强度和针尖与样品间的距离有函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。,将电流的这种改变图像化，即可显示出样品表面原子水平的凹凸形貌。,STM,的成像原理,第一节 细胞形态结构的观察方法,扫描隧道显微镜的分辨率很高（,横向为,0.1-0.2nm,纵向可达,）。,扫描隧道显微镜能直接观察,生物大分子,(,如,DNA,、,RNA,和蛋白质等,),的原子布阵,，也能观察一些,生物结构,(,如生物膜、细胞壁等,),的原子排列,。在生物学研究中发挥着重要作用，将把生物学研究推进到,纳米科学水平,。,其优越之处：,三态,（固态、液态和气态）,物质均可进行观察,。,STM,应用,第一节 细胞形态结构的观察方法,STM,下金原子的晶格排列图像,第一节 细胞形态结构的观察方法,扫描出的纳米级图像,STM,拍摄的“血细胞”,第一节 细胞形态结构的观察方法,STM特征,（1）具有原子尺度的高分辨率，侧向分辨率0.1-,0.2nm，纵向分辨率0.001nm。,（2）可以在真空、大气、液体,（接近于生理环境,的离子强度）,等多种条件下工作，这在生物,学研究领域尤其重要。,（3）可进行非破坏性测量，因为扫描可以不接触,样品，没有高能电子束轰击。,第一节 细胞形态结构的观察方法,亦称冰冻断裂,(freeze-fracture),，是研究,生物膜,内部结构的一种有用的技术，也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。,关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。,4.,冰冻蚀刻技术,(freeze-etching),第一节 细胞形态结构的观察方法,将标本于,-100,干冰中或,-196,液氮中，超低温冰冻。,然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构,蚀刻,(etching),。,蚀刻,断裂,冰冻蚀刻技术的操作步骤,:,第一节 细胞形态结构的观察方法,蚀刻后，,向断面以,45,度角喷涂一层蒸汽铂，再以,90,度角喷涂一层碳，加强反差和强度,。然后,用次氯酸钠溶液,将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为,复膜,(replica),。,复膜,复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。,第一节 细胞形态结构的观察方法,细胞冰冻断裂后的电镜图像,第一节 细胞形态结构的观察方法,冰冻蚀刻技术应用,形貌富有立体感，样品不需要包埋甚至也不需要固定，因而能更好地保持样品的真实结构。,冰冻蚀刻技术主要用于观察膜断裂面的蛋白颗粒和膜面结构。,第一节 细胞形态结构的观察方法,第二节 细胞组分的分析方法,一、细胞组分分离分析技术,二、生化与分子生物学技术,一、细胞组分分离分析技术,（一）离心技术,（二）流式细胞术,（三）细胞电泳,（四）层析技术,（五）电泳技术,第二节 细胞组分的分析方法,（一）离心技术,离心是分离和分析细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子复合体的基本手段。,一般认为，转速为1025Kr/min的离心机称为高速离心机；,转速超过25Kr/min，离心力大于89K者称为超速离心机。,目前超速离心机的最高转速可达100Kr/min，离心力超过500K g。,第二节 细胞组分的分析方法,离心机结构与原理示意图,马达,冷冻,真空,沉降物,转子,装甲室,第二节 细胞组分的分析方法,被离心的物质所受的,离心力,不仅与,转速,有关，而且还同,物质到转头中心的距离,有关。因此要,准确表示离心条件要用离心力，而不单是转速。,离心力,(g),是由,角速度（,）,和,旋转半径,(R),的大小决定的，单位为克，计算公式如下,:,RCF = 1.118 10,-5, ,2,R,第二节 细胞组分的分析方法,各种颗粒在离心场中的沉降速度不同，这取决颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬液介质的密度和粘度有关。即,式中,S,为沉降系数,(,秒,),；,V,为沉降速度；,R,为沉降颗粒到转头中心的距离,(cm),；,为角速度（弧度,/,秒）,当颗粒受到的净离心力（离心力与浮力之差）与溶剂的摩擦阻力达到平衡时，单位离心场强度的沉降速度为定值。每单位重力的沉降时间即为,沉降系数,(Sedimentation coefficient, S),。,S=V/,2,R,V=dr/dt,(,单位时间内旋转半径的改变,),FCR=M,2,r,或,2,r,第二节 细胞组分的分析方法,根据分离的对象和目的不同，超离心技术可分为两大类：,用于制备和纯化亚细胞成分和大分子，目的是制备样品,分析和测定制剂中大分子的种类和性质,(,浮力密度和分子量等,),制备离心,(preparative cetrifugation),分析离心,(analytical centrifugation),第二节 细胞组分的分析方法,利用肝脏制备各种亚细胞组分的制备离心过程示意图,匀浆物,肝脏,上清夜,完整,细胞,完整,细胞,1000g,20min,核,线粒体,溶酶体,过氧化物酶体,微粒体,内质网,100000g,120min,105000g,20min,DNase,静置,20min,10000g,20min,核糖体,第二节 细胞组分的分析方法,1差速离心（differential centrifugation）,基本原理：,在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞、细胞器、生物大分子。,第二节 细胞组分的分析方法,2密度梯度离心（density gradient centrifugation）,基本原理：,用一定的介质,（,氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖）,在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞组分按不同的速率沉降，形成不同的沉降带（分层、分离）。,差速离心将细胞器初步分离，密度梯离心进一步分离纯化。,第二节 细胞组分的分析方法,速度沉降,介质密度较低，变化平缓，离心力小，时间短。,主要用于,分离密度相近而大小不等,的细胞或细胞器。,等密度沉降,介质密度较高，变化陡峭，离心力大，时间长。,适用于,分离密度不等,的细胞器和大分子颗粒，不适于分离细胞,。,密度梯度离心的,2,种类型,第二节 细胞组分的分析方法,A等速度沉降，B等密度沉降,第二节 细胞组分的分析方法,差速离心,密度梯度离心,CsCl,密度,梯度离心,蔗糖密度,梯度离心,低速离心,中速离心,高速离心,超高速离心,细胞匀浆,细胞,核仁,细胞骨架,大细胞器,小细胞器,核糖体,大分子,离心,样品,蔗糖的稳定梯度,慢速沉降成分,快速沉降成分,分画,样品,蔗糖的不连续梯度,低浮力密度成分,高浮力密度成分,第二节 细胞组分的分析方法,（二）流式细胞术,流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。,包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）。,(fluorescence-associated cell sorting,FACS,),第二节 细胞组分的分析方法,激光,细胞悬液,鞘液,液滴加电信号,探测器,超声波振摇器,加负电的液滴,加正电的液滴,细胞收集容器,细胞收集容器,废液容器（未探测细胞）,FACS,工作原理,第二节 细胞组分的分析方法,流式细胞术应用,可以对细胞中DNA、RNA、蛋白质等含量进行定量分析；某含量的细胞数量测定。,分选细胞、细胞核、染色体、细胞器等。（如分选含X和Y染色体的精子等）,第二节 细胞组分的分析方法,（三）细胞电泳,在一定pH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳（cell electrophoresis）。,第二节 细胞组分的分析方法,引起细胞电泳的电位值称为电位。,在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的电位。,电位常因细胞,生理状态和病理状态,而异，因此在诊断疾病上有一定价值。,各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。因此，细胞电泳可用来分离不同种类的细胞，例如可把淋巴样细胞与造血细胞分开。,第二节 细胞组分的分析方法,（四）、,层析技术,用于细胞组分的分离及其纯化,1.,凝胶过滤层析,第二节 细胞组分的分析方法,2.,离子交换柱层析,第二节 细胞组分的分析方法,3.,亲合层析,第二节 细胞组分的分析方法,层析技术纸层析法,separation of small molecules by paper chromatography,After the sample has been applied to one end of the paper (the origin) and dried, a solution containing a mixture of two or more solvents is allowed to flow slowly through the paper by capillary action. Different components in the sample move at different rates in the paper according to their relative solubility in the solvent that is preferentially adsorbed onto the fibers of the paper.,第二节 细胞组分的分析方法,层析技术柱层析,The sample is applied to the top of a cylindrical glass or plastic column filled with a permeable solid matrix, such as cellulose, immersed in solvent. Then a large amount of solvent is pumped slowly through the column and is collected in separate tubes as it emerges from the bottom. Various components of the sample travel at different rates through the column and are thereby fractionated into different tubes.,The separation of,molecules by column,chromatography.,第二节 细胞组分的分析方法,Three types of matrices used for chromatography.,In ion-exchange chromatography (A) the insoluble matrix carries ionic charges that retard molecules of opposite charge. Matrices commonly used for separating proteins are DEAE-cellulose, which is positively charged, and CM-cellulose and phosphocellulose, which are negatively charged. In gel-filtration chromatography (B) the matrix is inert but porous. Molecules that are small enough to penetrate into the matrix are thereby delayed and travel more slowly through the column. Beads of cross-linked polysaccharide (dextran or agarose) are available commercially in a wide range of pore sizes, making them suitable for the fractionation of molecules of various molecular weights, from less than 500 to more than 5 x 106. Affinity chromatography (C) utilizes an insoluble matrix that is covalently linked to a specific ligand, such as an antibody molecule or an enzyme substrate, that will bind a specific protein.,第二节 细胞组分的分析方法,（五）电泳技术,SDS polyacrylamide-gel electrophoresis (SDS-PAGE),第二节 细胞组分的分析方法,Two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis.,All the proteins in an,E. coli,bacterial cell are separated in this gel, in which each spot corresponds to a different polypeptide chain. Note that different proteins are present in very different amounts. The bacteria were fed with a mixture of radioisotope-labeled amino acids and the result was detected by auto-radiography.,第二节 细胞组分的分析方法,二、生化与分子生物学技术,（一）细胞化学技术,（二）免疫细胞化学,（三）放射自显影术,（四）分子杂交技术,（五）PCR类技术,第二节 细胞组分的分析方法,（一）细胞化学技术,基本原理：,组织化学或细胞化学染色（histochemical or cytochemical staining）是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。,对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。,第二节 细胞组分的分析方法,组织化学和细胞化学染色方法,(histochemical and cytochemical staining method),依据化学反应原理，对无色透明细胞的某些成分进行定性和定位研究。,细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成份发生反应而着色的原理，从而得以对某种成份进行研究和分析。,利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。,第二节 细胞组分的分析方法,最典型的组织化学显示法是,Feulgen,反应显示法,(Feulgen reaction),。此法由,Feulgen,和,Rossenbeck (1924),发明，对,DNA,的反应具有高度专一性。,其原理是,:,标本经稀盐酸水解后，,DNA,分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了,醛基,。,Schiff,试剂中的,无色品红,与醛基反应，形成含有,醌基,的化合物，醌基为发色团，呈现出,紫红色,。,第二节 细胞组分的分析方法,第二节 细胞组分的分析方法,1固定方法,目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来。,（1） 物理固定：,如冷冻干燥或直接冷冻切片。,（2） 化学固定：,如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和,锇酸等试剂均能对细胞结构和其中的某些化,学物质加以固定保存。,第二节 细胞组分的分析方法,2显示方法,1） 金属沉淀法：,利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。,如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。,2） 偶氮偶联法：,酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。,3）Schiff反应：,细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。这种反应通常用于显示多糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应，红色）。,第二节 细胞组分的分析方法,4） 联苯胺反应：,过氧化物酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。,5） Formazane反应：,显示脱氢酶。,6）,“Nadi”反应：,显示细胞色素氧化酶。,7）脂溶染色法：,借苏丹III染料溶于脂类而使脂类显红色。,8）茚三酮反应：,显示蛋白质。,第二节 细胞组分的分析方法,3显示方法举例,核酸反应,Feulgen反应：,DNA+Shiff试剂,紫红色,Brachet反应：,派洛宁染液（甲基绿+DNA,蓝绿色,）,（吡咯红+RNA,红色,）,第二节 细胞组分的分析方法,蛋白质的Millon反应：,氮-汞试剂+蛋白质（酪氨酸）,红色,第二节 细胞组分的分析方法,酶反应,碱性磷酸酶的Gomori反应：,甘油磷酸脂,甘油,+H,3,PO,4,磷酸酶,H,3,PO,4,+Ca,2+,Ca,3,(PO,4,),2,+H,+,Ca,3,(PO,4,),2,+Co,2+,Co,3,(PO,4,),2,(,黑色）,+ Ca,2+,Ca,3,(PO,4,),2,+3H,2,S,3CaS (,黑色）,+ H,3,PO,4,第二节 细胞组分的分析方法,多糖反应,PAS反应：,可用于多糖、粘多糖、粘蛋白的检测。,多糖+过碘酸+无色品红,紫红色,第二节 细胞组分的分析方法,脂类反应,四氧化锇+脂肪酸（不饱和） 黑色,苏丹可使脂滴着红色，苏丹黑可使磷脂和胆固醇着黑色。,第二节 细胞组分的分析方法,免疫细胞化学是根据免疫学原理，利用,抗体,同特定,抗原,结合，对抗原进行,专一定位,测定的技术。,如果将抗体结合上,标记物,，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。,（二）、免疫细胞化学,(immunocytochemistry),第二节 细胞组分的分析方法,常用的标记物有,荧光素,和,酶,：,标记荧光素的称为,免疫荧光法,(immunofluorescent technique),，常用的萤光素有,异硫氰酸荧光素,(FITC),、,罗丹明,(rhodamine),等。,标记酶的称为,酶标免疫法,(enzyme-labelled antibody method),，常用的酶有辣根过氧化物酶,(horseradish peroxidase),等，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物或有色物，从而显示出抗原的存在部位。,第二节 细胞组分的分析方法,抗体与抗原的结合方法可分为以下两种：,直接法,间接法,将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位,在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的,次级抗体,与,初级抗体,反应，从而使初级反应得到放大，增强显示效果,第二节 细胞组分的分析方法,间接免疫细胞化学法的原理示意图,次级,抗体,初级,抗体,标记物,第一抗体（一抗）,第二抗体（二抗）,第二节 细胞组分的分析方法,微管呈绿色,微丝红色,核蓝色,第二节 细胞组分的分析方法,用荧光素标记抗体所显示出的细胞中几种蛋白质的分布状态,IRS-1,胰岛素抗原,IRS-1+Bcl-2,Bcl-2,胰岛素单克隆抗体,第二节 细胞组分的分析方法,Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,（,ELISA),此颜色深浅可用酶标仪精确地测定出来,酶联免疫吸附试验,酶与底物反应产生有色产物，颜色深浅代表了反应的强弱,卤虫孵化腺细胞的,ELISA,染色照片,(,樊廷俊等, 2003),第二节 细胞组分的分析方法,（三）放射自显影术 (autoradiography),用于研究生物大分子（DNA、RNA、蛋白质、多糖等）在机体、组织和细胞中的分布、定位、合成动态、作用机理等。,第二节 细胞组分的分析方法,放射性同位素发射出的各种射线能使照相乳胶中的溴化银晶体还原,(,感光,),。利用放射性物质使照相乳胶膜产生该物质自身影像的技术，称为,放射自显影术,。,放射自显影的切片用染料染色后，便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或定量测定。,第二节 细胞组分的分析方法,由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用,14,C,和,3,H,标记,(,14,C,和,3,H,均为弱,放射性同位素，半衰期长,:,14,C,为,5730,年,;,3,H,为年,),。,一般,常用,3,H,胸腺嘧啶脱氧核苷来显示,DNA,，用,3,H-,尿嘧啶核苷显示,RNA,。在研究,蛋白质,和,粘多糖,时，则分别选用,3,H-,氨基酸和,3,H-,甘露糖,、,3,H-,岩藻糖,等。,第二节 细胞组分的分析方法,基本步骤、原理,标记的前体小分子饲喂生物体或细胞,（核苷酸、氨基酸、脂肪酸等）,制片,涂卤化银乳胶,放射自显影,（曝光、显影、定影）,观察（光镜、电镜）,：,确定标记物的位置和数量,第二节 细胞组分的分析方法,In situ,hybridization for RNA localization in tissues.,Autoradiograph of a s