定量方法 演示文稿.

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因定量研究的方法,苏州大学,卫正国,分子遗传学中基因的概念,基因的本质：,（1）基因是特定,长度,和,碱基序列,的DNA片段,（2）核苷酸序列中蕴藏着遗传信息,中心法则,中心法则(genetic central dogma),是指遗传信息从,DNA,传递给,RNA,，再从RNA传递给,蛋白质,，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。,中心法则(genetic central dogma),遗传信息并不一定是从DNA单向地流向RNA，RNA携带的遗传信息同样也可以流向DNA。但是DNA和RNA中包含的遗传信息只是单向地流向蛋白质，迄今为止还没有发现蛋白质的信息逆向地流向核酸。这种遗传信息的流向，就是克里克概括的中心法则(central dogma)的遗传学意义。,中心法则(genetic central dogma),任何一种假设都要经受科学事实的检验。,反转录酶的发现，使中心法则对关于遗传信息从DNA单向流入RNA做了修改，遗传信息是可以在DNA与RNA之间相互流动的。,那么，对于DNA和RNA与蛋白质分子之间的信息流向是否只有核酸向蛋白质分子的单向流动，还是蛋白质分子的信息也可以流向核酸，中心法则仍然肯定前者。,定量与定量方法,自从1970年克里克提出分子生物学的中心法则以来，人们对于基因的转录表达和及其调控的机制进行了大量的研究。,1、Northern杂交方法是最早被用来,测定基因转录量,的方法,2、后来，结合逆转录和聚合酶链式反应产生的RT-PCR提供了一种灵敏而又简便的半定量测定方法。,3、近年来，实时定量聚合酶链式反应(qPCR)方法的出现由于其灵敏、准确和重复性好逐步成为基因表达的定量测定的,主要方法,。,PCR,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称,，是,一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,荧光定量,PCR,（,real-time PCR),通过荧光染料或荧光标记的,特异性的探针,对PCR产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。,Excitation,Emission,5,3,5,3,SG,SG,SG,SG,SG,SYBR GREEN I,新方法的思考,所有上述方法，为了减少由于RNA不稳定和逆转录的效率问题产生的误差，通常采用内参或者用相同量的总RNA来对数据进行归一化。这些内参通常选用一些看家基因如-actin, GAPDH and rRNA等。,然而，众所周知，不同组织间总RNA的量差别很大，那些内参基因在不同组织中的表达也不是一样的，即使在同一组织不同条件下也不一定是相同的。,此外，还有利用外源的RNA在实时定量PCR中进行跟踪标定（spike-in qPCR）的方法，此方法结合绝对标准曲线可以产生更加可靠的结果。,利用这些策略，一个基因的转录水平实际上被表示为与一个参考（内参或外参）基因的相对表达量。因此，非常需要一个真正的、可靠的基因的转录水平。,为此，我们提出了一个新的策略既测定靶基因的转录产物的拷贝数又测定此基因的拷贝数，这样可以用每个基因的转录量来表示这个基因的转录水平。这个策略使用了RNA和DNA双外参来分别对转录产物和基因进行跟踪标定，称为,daul-spike-in qPCR,技术。考虑到各基因转录产物的寿命是不一样的，这里测得的基因转录水平被称为,“,表观转录水平,”。,我们用家蚕做模式系统来测定不同基因在各组织中的表观转录水平。家蚕的基因的表达明显地在空间与时间上受到调控，例如丝素蛋白专一地在5龄家蚕的后部丝腺表达，而丝胶蛋白则在中部丝腺表达。这对于研究基因的组织专一性表达，并发展测定方法十分有利。,我们测定了家蚕幼虫丝腺的不同部位、脂肪体、马氏管、中肠中细胞质肌动蛋白(cytoplasmic actin, A3)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、28S核糖体RNA(28S rRNA)的表观转录水平。发现A3, GAPDH、28S rRNA这些常被用作内参的基因在不同组织中的表达差别非常大，说明采用新的策略是非常必要的。,A3基因在家蚕幼虫各组织中的表观转录活性,Apparent transcriptional activity of A3 gene in various tissues of,B. mori,larvae,.,GAPDH基因在家蚕幼虫各组织中的表观转录活性,Apparent transcriptional activity of GAPDH gene in various tissues of,B. mori,larvae,28SrRNA基因在家蚕幼虫各组织中的表观转录活性,Apparent transcriptional activity of 28SrRNA gene in various tissues of,B. mori,larvae.,测定方法,FibH in PSG,FibL in PSG,Ser-1 in MSG,mRNA/DNA,106453,192029,196539,mRNA / A3 mRNA,96.987,174.95,1607.7,mRNA /GAPDH mRNA,689.51,1243.8,18208,mRNA /28S rRNA mRNA,0.039357,0.070995,0.11037,表观转录活性和相对表达量的比较,Comparison of the apparent transcriptional level and the relative expressions,本发明极大地改进了对基因转录水平检测的实验设计，使得人们可以得到某个基因的真实的转录水平而不是一个相对水平。此策略对于芯片分析以及芯片数据的整合同样。,P450基因,外来物,生理过程相关物质,药物包括抗生素,致癌物,抗氧化剂,添味剂,溶剂,农药,染料,麻醉剂,石油产品,醇类,甾类,类花生四烯酸,脂肪酸,丙酮、丙酮醇,脂过氧化氢,类视黄酸,mRNA/DNA混合液,供试家蚕样品,TRNzol-A,组织匀浆,12,000 rpm , 15 min,去上清后,抽DNA,上清抽总RNA,测定,逆转录,测定,上清加0.2ml氯仿,12,000 rpm , 15 min,氟化物添食,解剖组织,CYP4M9,在血细胞中NaF诱导的表观转录活性,Apparent transcriptional activity of,CYP4M9,gene induced by NaF in haemocyte.,CYP6AB4,在丝腺中NaF诱导的表观转录活性,Apparent transcriptional activity of,CYP6AB4,gene induced by NaF in silk gland.,P450基因在马氏管中NaF诱导的表观转录活性(),Apparent transcriptional activity of,P450,gene induced by NaF in Malpighian tubule().,P450基因在马氏管中NaF诱导的表观转录活性 (),Apparent transcriptional activity of,P450,gene induced by NaF in Malpighian tubule().,P450基因在脂肪体中NaF诱导的表观转录活性(),Apparent transcriptional activity of,CYP9A19,gene induced by NaF in fat body of,B.mori,().,P450基因在中肠中NaF诱导的表观转录活性(),Apparent transcriptional activity of,CYP9A19,gene induced by NaF in middle gut of,B.mori,().,P450基因在中肠中NaF诱导的表观转录活性(),Apparent transcriptional activity of,CYP9A19,gene induced by NaF in middle gut of,B.mori,().,