第五章 DNA损伤修复与重组

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,第五章,DNA,损伤与修复,DNA damage and repair,第一节,DNA,损伤的原因及后果,电离辐射,可见光,氧自由基,H,+,烷化剂,8-oxoG,P/P,复制错误,核苷类似物,m,C,U,DNA,损伤类型,细胞内源性损伤因素,DNA,复制错误；,自发损伤（,碱基互变异构、碱基脱氨（,C-U,，,A-I,）及碱基丢失等,）,环境中的损伤因素,辐射（,紫外线、,X,射线和电离辐射,）；,化学致癌物（,氧化脱氨，烷化剂或代谢活化物如苯并芘、黄曲霉素等产生碱基加合物,）,DNA,损伤类型（细分）,碱基脱落,碱基修饰,&,去氨基化,化学修饰,光损伤,链内交联,DNA-,蛋白质 交联,DNA,链断裂,DNA,重组,缺失碱基位点,化学损伤,甲基化,甲基化,甲基化,氧化损伤,氧化损伤,DNA,受到大剂量紫外线照射时，形成二聚体,紫外线可引起,DNA,的交联, DNA,与蛋白质的交联。,电离辐射引起,DNA,损伤的机理,电离辐射引起,DNA,损伤的类型,产生,OH,自由基，导致,碱基,变化,脱氧核糖,分解,DNA,链,断裂,DNA,链、蛋白质的,交联,电离辐射导致,DNA,链的断裂,单链断裂：,无差错修复,双链断裂：,错误修复,C,烷化剂引起,DNA,损伤,碱基烷基化,: GC AT,碱基脱落,:,甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤,7,N,烷基化，活化,糖苷键，连,接,碱,基,与,五碳糖,间,的共,价键变,弱，容易折,断,缺,失碱,基，,造成脱嘌呤作用。,导致,DNA,断链,:,磷酸二酯键上的氧被烷基化,导致,DNA,链交联,5-BrdU,（酮式,-A,； 烯醇式,-G,）,碱基类似物、修饰剂对,DNA,的改变,亚硝酸盐氧化脱氨 （,CU,）,羟胺脱甲基 （,TC,）,黄曲霉素,B,（攻击碱基）,DNA,自发性损伤,碱基错配,Mismatch,互变异构移位,脱氨基作用,(,环外氨基,),碱基丢失, 自发水解,碱基修饰与链断裂,碱基异构式引起,DNA,复制的错配,错误配对,G(k),T(e),A(a),C(i),A(i),C(a),G(e),T(k),G(k) C(a),正确配对,A(a),T(k),环出效应,其它因素引起,DNA,损伤,吖啶类化合物,:,吖啶橙,扁平染料分子,(,不等交换,),氧自由基,(,加成反应,小自由基反应,),DNA,损伤的后果,信号传导异常,长时辰效应,老化,肿瘤,疾病,DNA,修复机制,短期效应,异常增生和代谢,生理功能紊乱,细胞死亡,细胞增殖减少,基因表达异常,基因组不稳定,DNA,损伤后分子的最终改变,点突变,： 转换与颠换,缺失,插入,倒位或转位,DNA,断裂,DNA,重排,DNA,分子内发生较大片段的交换，可以在同一染色体的两条链间发生，也可在不同染色体之间发生，可以是原来的方向或颠倒的方向。,第二节,DNA,修复,DNA,的修复主要类型,:,直接修复,光裂合酶修复,切除修复,重组修复,跨损伤修复,(SOS,修复,),常见的,DNA,损伤及其修复机制,DNA,损伤因素,DNA,损伤类型,修复机制,X,射线、氧自由基、烷化剂,自发脱碱基,单链断裂、无碱基位点、氧化性碱基（如,8-,氧鸟嘌呤）脲嘧啶,碱基切除修复,紫外线和多环芳烃,环丁烷嘧啶二聚体等大的紫外线光产物和稳定的多环芳烃化合物等大分子,DNA,加合物,核苷酸切除修复,抗癌药（如顺铂和丝裂霉素）,双链断裂和链间交联,双链断裂修复（同源重组修复和末端连接）,复制错误和烷化剂,碱基错配和缺失（插入）,错配修复,（,1,）,DNA,断裂口直接修复：,在,DNA 5-P,端和,3-OH,端未受损害的情况下，连接酶能够直接修复,DNA,的断裂口。,（,2,）,DNA,紫外线损伤的光复合酶直接修复,（,3,） 烷基化碱基的直接修复,在 大肠杆菌中的,Ada,酶，可修复甲基化的碱基和甲基化的磷酸二酯键。,碱基切除修复,指切除和替换由内源性化学物作用产生,的,DNA,碱基损伤,是切除修复的一种。,受损碱基移除是由多个酶来完成的。,主要针对,DNA,单链断裂和小的碱基改变,及氧化性损伤。,(4) Base Excision Repair,DNA,的损伤的切除修复,碱基缺陷或错配,碱基丢失,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA,聚合酶,DNA,连接,酶,AP,核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,插入酶,碱基取代,核苷酸切除修复,体内识别,DNA,损伤最多的修复通路,主要修复扭曲双螺旋结构的,DNA,损伤以及阻断基因转录和不识别任何特殊的碱基损失，而是识别双螺旋形状的改变。,不识别任何特殊的碱基损失，而是识别双螺旋形状的改变；修复时切除含有损伤碱基的那一段,DNA,。,(5),核苷酸切除修复,(,大肠杆菌,),错配修复,校正活性所漏校的碱基,使复制的保真性提高,10,2,10,3,倍,错配修复系统,(MRS,Mismatch,Repair,System),DNApol (= 10,-8,),经第二次校正,= 10,-11,错配修复系统组成（,Mismatch repair system,）,DNA,腺嘌呤甲基化酶,(m6A,甲基化酶,),DNA polymerase ,填补单链,DNA,缺口,Helicase SSB,外切核酸酶,(,和,),连接酶,MCE,(mismatch correct enzyme),3 subunits,mut H, L, S,扫描新生链中错配碱基,识别新生链中非,m,6,A,的,GATC,序列,酶切含错配碱基的,DNA,区段,错配修复,错配修复,大肠杆菌,DNA,甲基化位点,新合成的,DNA,Mis-paired bases,错配修复,（,6,）,重,组,修,复,DNA,于复制时会,越,过,受,损区域,进行复制,经,重,组,修,复,，,受,损,的,DNA,仍然存在,于子代的,一个细胞中。,重,组,修,复,不,会,浪,费时间,， 重,组,修,复,可,让负伤,的,DNA,在细,胞中仍可,照常,进,行分裂,。,重组修复机制,非同源末端连接,：,DNA,分子之间不需要广泛的同源性，主要是在免疫球蛋白重组时对,DNA,双链进行连接，在细胞有丝分裂,G,1,/G,0,期起主要作用。,重组修复,根据,DNA,末端连接需要的同源性，分为,同源重组,：需要多种蛋白参与；也修复,DNA,复制中的差错；在减数分裂、细胞有丝分裂后期,S/G2,期起主要作用。,（,7,）,SOS,修复,DNA,分子多处受到较大范围的损伤，,应急诱导产生的修复作用称,SOS,修复,细胞能继续生存，但,引起,DNA,较长期的广泛的突变,后果：,(7),SOS,修复,Irradiation of bacteria before virus infection enhanced repair of damaged viral genes but led to mutations.,UV,UVd T4 phage,E. coli,Few surviving phage,UVd T4 phage,E. coli,Higher frequency of,surviving,phage, but many,mutants,.,DNA,修复的意义,维持,DNA,序列的保真性；,可在复制前后进行；,有,多种修复机制,来纠正,DNA,损伤；,DNA,修复失败可能导致突变和肿瘤。,细胞周期检查点控制,真核生物细胞,DNA,受到损伤时细胞除了诱导修复基因的转录外，还可暂时阻断细胞周期，防止受损,DNA,继续复制，如无法修复，则可诱导细胞进入凋亡。这些都是细胞通过细胞周期检查点控制（,checkpoint control,，又称关卡控制）对,DNA,损伤的应答反应。,第三节,DNA,损伤和修复的生物参考标志,一、甲基化损伤修复相关基因,甲基转移酶（,MGMT,）把,O,6,-,甲基鸟嘌呤的甲基转移到自身的半胱氨酸残基上，修复甲基化的,DNA,。,MGMT,突变可作为甲基化损伤的基因型标记物。,二、切除修复相关的酶和基因,尿嘧啶糖基化酶为主要的始动因素，,可,作为,DNA,损伤的生物标记物。,大肠杆菌,Uvr,基因家族、人,ecrr,基因和切除修复基因等,三、错配修复相关基因,MSH2,、,MLH1,等蛋白参与,错配修复，而错配修复的缺陷往往是癌变的第一步。,错配修复基因：,Muthls,系统、人类的,hmsh2/3,、,hpmsl1/2,、,Mutsa,、,msh6,。,错配修复基因的微卫星序列的不稳定性,（,microsatellite,instability,，,MI,）,四、,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,参与辐射损伤和化学损伤的,修复，并对细胞的生长具有调节作用。,DNA,聚合酶,的突变可导致碱基切除修复功能的缺陷,。,五、,DNA,加合物也可作为修复功能的生物标记物,DNA,加合物可作为,DNA,损伤的暴露标记物和效应标记物，其去除的速度也可作为,DNA,修复功能的生物标记物。,DNA,损伤和修复的生物学意义,避免基因组的不稳定性、癌症和细胞死亡是至关重要的。,DNA,修复途径可以识别和修复特异的,DNA,损伤，保证生物物种的遗传稳定性。,与,DNA,修复,有,关,的人,类遗传,疾病：,着,色性,干,皮病,(Xeroderma pigmentosum),布,伦,氏症候群,(Blooms syndrome),遗传,性大,肠,癌,(Hereditary nonpolyposis colon cancer,；,HNPCC),着,色性,干,皮病,(Xeroderma pigmentosum),是一种隐性遗传性疾病，有些呈性联遗传。因核酸内切酶异常造成,DNA,修复障碍所致。临床以光暴露部位色素增加和角化及癌变为特征。,1.,幼年发病，常有家族发病史。,2.,面部等暴露部位出现红斑、褐色斑点及斑片，伴毛细血 管扩张，间有色素脱失斑和萎缩或疤痕。皮肤干燥。数年内发生基底细胞癌、鳞癌及恶性黑素瘤。,3.,皮肤和眼对日光敏感。,4.,病情随年龄逐渐加重，多数患者于,20,岁前因恶性肿瘤而死亡。,5.,组织病理 晚期出现表皮非典型性增生、日光角化及鳞癌和基底细胞癌等恶性肿瘤。,着,色性,干,皮病,患儿脸部特征,着,色性,干,皮病,背部,着,色性,干,皮病,组织切片,着,色性,干,皮病,的治疗,避免紫外线照射,避免肿瘤致病因子,对症治疗,遗传,性大,肠,癌,的临床特征,发病早,(45,岁,),肿瘤好发部位,肠外肿瘤的类型,遗传,性大,肠,癌,(HNPCC),息肉较少,30-60%,有内膜肿瘤,恶性肿瘤好发部位,胰腺癌发生率,大肠癌发生的危险因素,(CRC),0,20,40,60,80,100,General population,Personal history of colorectal neoplasia,Inflammatory bowel disease,HNPCC mutation,FAP,5%,15%20%,15%40%,70%80%,95%,Lifetime risk (%),错配基因的改变,多发性家族性结肠癌,多发性家族性结肠癌,错配基因的改变,:,MSH2, MSH6, PMS1,，,MLH1, MSH3, PMS2.,HNPCC,中错配基因突变的概率,MSH2,30%,MLH1,30%,PMS1,(rare),PMS2,(rare),MSH6,(rare),Unknown 30%,Sporadic,Familial,HNPCC,FAP,Rare CRC,syndromes,Liu B et al.,Nat Med,2:169, 1996,HNPCC,发生的危险因素,基因携带者,发生的危险因素,:,早期,: 20-25,岁,妇女,:,年龄,(?) 25-35,岁,HNPCC,家族成员之一发生的概率,:,胃癌发生,:,早期发生年龄,3-35,岁,复发,1-2,年,尿道肿瘤发生,: 30-35,岁,复发,1-2,年,第四节,DNA,的重组与转座,A,概述,一、,DNA,重组,（,recombination,）,1,、概念：是指由于不同,DNA,链的断裂和连接而产生的,DNA,片段的交换和重新组合，形成新的,DNA,分子的过程。,2,、意义：重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术,二、,DNA,重组的类型,1,、同源重组,（,Homologous Recombination,）,2,、位点特异性重组,（,Site-specific Recombination,）,3,、,DNA,的转座,（,transposition,）,B,同源重组,一、概述,1,、定义：两个,DNA,分子同源序列之间进行的重组,2,、条件：,（,1,）两个,DNA,分子,有同源序列,（相关的酶可以用任何一对同源序列为底物）,（,2,）两个,DNA,分子,必须紧密接触,3,、发生：,真核生物,:,非姐妹染色单体交换相对应的区域。,原核生物,:,依赖,recA,蛋白，并形成,Holliday,结构,Holiday,模型,（,1964,年,）,二、大肠杆菌同源重组的分子基础,（一）,RecA,1,、作用：可促进,单链同化或单链吸收,RecA,具有使,DNA,单链置换双链中同源链的能力,特异地识别单链,DNA,，并能将之与同源,DNA,中的互补顺序“退火”，同时将另一条链排挤出去（取代），形成杂种分子,2,、单链同化发生的三个条件,（,1,）其中一个,DNA,必须存在单链区,（,2,）其中一个,DNA,必须有一个自由,3,末端,（,3,）此单链区和,3,末端必须位于两分子之间互补的区域内,（二）,RecBCD,复合体,1,、酶的活性：,（,1,）,核酸酶,（,2,）,解旋酶,（,3,）,ATPase,2,、作用：,在,Chi,位点处产生含,3,游离未端单链,.,（,三）,Chi,位点,-RecBCD,识别的靶位点,5,GCTGGTGG 3,3 CGACCACC 5,是重组频率较高的部位,中每隔约,510,kb,有一个拷贝，,断裂和重连产生异源双链,DNA,1.,同源序列排列在一起；,2.,酶切。通过,核酸酶,和,RecBCD,蛋白复合体,的作用在一对同源,DNA,上产生切口；,3.,入侵。含有,3,端切口的,ssDNA,被,recA,蛋白包裹形成,recA,蛋白,-ssDNA,细丝,；,RecA-ssDNA,细丝寻找相对的,DNA,双螺旋上的相应序列。,三、细菌同源重组,的机制,-,Holiday,重组模型,4.,游离端交叉连接，形成,Holliday,结构,5.,通过分支迁移产生异源双链,DNA,。,十字形结构,6.,空间重排。十字型两臂旋转,180,度,7.,解离,(,两种不同方式,),8.,修补连接,附：,基因敲除,( Gene knockout),是,80,年代后半期应用,DNA,同源重组,原理发展起来的一门新技术,.,是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验材料，推测相应基因的功能。,基因敲除的技术路线如下：（,1,）构建重组基因载体,（,2,）用电穿孔、显微注射等方法把重组,DNA,转入受体细胞核内,基因敲除的靶细胞目前最常用的是小鼠,ES,细胞,（,3,）用选择培养基筛选已击中的细胞,（,4,）转入假孕母鼠使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。,C,位点特异性重组,一、定义：,不依赖于,DNA,顺序的同源性，而依赖于能与某些酶相结,合的特异的,DNA,序列的存在。,二、噬菌体,对,DNA,的整合,（一）,DNA,存在两种形式,裂解状态,溶源状态,（二）通过位点特异性重组实现两种类型间的转换,DNA,整合到,宿主,DNA,进入溶源状态,DNA,从宿主,DNA,中,切离,进入裂解状态,（三）催化重组的酶,1,、整合酶,Int (integrase),：有拓扑异构酶活性,2,、整合宿主因子（,IHF,，,integration host factor,）,3,、切除酶（,excisionase,）,/,终止重组,（四）重组位点：,附着位点,（,attachment site,）,attP,（,POP,）和,attB,（,BOB,）有,15bp,核心序列配对,（五）重组过程：,1,、整合：,POP + BOB BOPPOB,2,、切离：,BOPPOB POP + BOB,attP,attB,（,1,）具有对特异性,DNA,强烈亲和力的,Int,与,attP,和,attB,位点结合。,（,2,）,Int,的拓扑异构酶活性，使两条双链各自断开一条单链，瞬间旋转然后交换连接。,（,3,）同时在另两条单链之间发生同样的断裂重接，从而完成双链间的重组。,整合的过程,D DNA,的转座,一、转座子（,transposon,）的定义：,存在于染色体,DNA,上可自主转移座位的基本单位,二、转座子发现：,McClintock B,：,1938,年，提出转座基因概念,1944-1950,，阐明“,Ds-Ac,调控系统”,1983,年，获诺贝尔生理医学奖,等：,1980,年，证实了可移位的遗传基因存在,三、转座成分概述,1,、转座子,(,元,),或转座元件,(transposon or transposable element):,即能够反复插入到基因中许多位点的特殊,DNA,片段，它们可从一个位点转移到另一个位点，从一个复制子到另一个复制子。（在转移时原来位置上的这些结构依然存在或不存在）。,2,、特点：, 不必借助同源序列就可移动的,DNA,片段，即转座作 用与供体和受体之间的序列无关。, 原核生物和真核生物均有转座子。 转座序列可沿染色体移动，甚至在不同染色体间跳 跃。,四、转座子的基本结构特点,1,、自身携带有转座酶基因,2,、末端有反向重复序列（,IR,）,3,、转座后两端有正向重复序列（,DR,）,ATGCA,12345678,TACGT,12345678,87654321,ATGCA,87654321,TACGT,转座酶基因,插入序列（,insertion sequences,，,IS,）,四、转座子的类型,（一）细菌转座子,1,、,IS,（插入序列, insertion sequences,）,特点（,1,）比较小，,0.751.5kb;,（,2,）只有转座酶,基因,（,3,）,两端有反向重复序列,IR,（,inverted repeat,）,IS,Transposase,IR,ATGCA,12345678,TACGT,12345678,87654321,ATGCA,87654321,TACGT,Target,repeat,Inverted,repeat,IS1 9 bp,23 bp,768 bp,IS2 5 bp,41 bp,1327 bp,IS411-13 bp,18 bp,1428 bp,IS5 4 bp,16 bp,1195 bp,IS10R 9 bp,22 bp,1329 bp,IS50R 9 bp,9 bp,1531 bp,IS903 9 bp,18 bp,1057 bp,ATGCA,TACGT,2,、,Tn,（复合转座子, composite transposons,）,特点：,（,1,）,2-10kb;,（,2,）两端有两个相同或高度同源,IS,序列,（,3,）含转座酶基因,/,抗生素基因,Transposon makers,Tn,IS,IS,IRL,IRR,Transposon makers,Transposon makers,Tn9IS1,cam,R,IS moduls identical,both functional,Tn903IS903,kan,R,both IS functional,Tn10IS10L,tet,R,IS10R,nonfunctional functional,Tn5IS50L,kan,R,IS50R,nonfunctional functional,3,、,TnA,（,TnA family,）,特点：,（,1,）,525kb;,（,2,）两端,IR,（,3040bp,）相似或相同；两端无,IS,组件,;,（,3,）转座酶基因,/ 解离酶基因 /,抗生素基因,（,4,）,Res,位点：与共整合体的解离有关,TnA,Res,Transposase,Resolvase,Amp,r,IR,IR,（二）真核生物转座子,1,、特点：,（,1,）两端有,IR,，,（,2,）内部有转座酶等基因；,2,、举例：,玉米转座子,Ac/Ds,，,Spm/dSpm,；,果蝇,P,因子,（一）转座相关的酶,1,、转座酶,:,（,1,）识别转座子的两端序列和受体,DNA,的靶序列,（,2,）切割使转座子从供体,DNA,中释放出来,（,3,）在靶位点上作出交错的切割,(,类似限制酶,),（,4,）催化一对转酯反应，使转座子,3,端与靶位,点相连,2,、解离酶,:,（,1,）,TnA,家族转座必须,（,2,）催化两个转座子拷贝间的位点特异性重组,五、转座机制,（二）非复制型转座,ATGCA,TACGT,插入,ATGCA,TACGT,ATGCA,TACGT,补齐,ATGCA,TACGT,剪切,1,、非复制型转座定义,转座子作为一个可移动的单位直接被移位，留下一个供体位点（通常产生一个双链断裂的缺口）。,2,、非复制型转座过程,（,1,）转座酶使转座子从供体,DNA,中释放出来；,转座酶使受体,DNA,靶位点形成交错切口；,（,2,）转座子插入交错切口,(,转座酶,-,转酯反应,),，,（,3,）连接并修复缺口单链，受体,DNA,产生同向重复序列。,（三）,复制型转座,1,、定义：整个转座子被复制，所移动和转位的仅,仅是原转座子的拷贝。,1,a,b,c,d,e,f,g,h,2,a,c,b,d,e,g,h,f,3,a,c,b,d,e,g,h,f,5,a,c,e,g,b,d,f,h,4,e,g,b,d,a,c,f,h,2,、复制型转座过程,：,（,1,）转座酶使转座子和受体,DNA,双链形成交错切口；,（,2,）转座子两端形成复制叉，复制、连接补齐缺口，,形成共整合体；,（,3,）位点特异性重组（解离酶）；,（,4,）受体,DNA,产生同向复序列。,3,1,4,2,3,4,共整合体,转座机制,六、转座频率和转座抑制,（一）,转座频率,不同转座元件的转座频率不同。一般为每代,10,-3,10,-4,次,/,元件,，可能与转位酶的水平,有关,。,（二）,转座抑制,1,、,DNA,甲基化抑制转座子的活动,2,、,RNA silencing,抑制转座子的活动,七、转座的特点,1.,不需要序列同源性，也不是位点特异性的,2.,效率较低,3.,需要转座子编码的转座酶,4.,可发生在同一染色体内或不同染色体之间,5.,可以转移到一个新的基因组中的几乎任何部位处，但它们也不能完全随机转移，而是对某些,DNA,序列有倾向性,八、转座作用的遗传学效应,1,、可引起基因突变,插入或切离；,2,、可以产生新基因；,如携带抗药性基因的转座子，既可引起插,入突变，也使该位点产生抗药性。,3,、转座产生染色体畸变（缺失、倒位等）,4,、产生新的变异，有利于进化。,转座直接或间接促进基因组的重排，使相距较 远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或表达单元，可能产生一些具有新的生物学功能的基因。,转座是产生变异的主要因素之一,九、转座生物学效应举例,Ds,Ds,Color gene,Ac,自主性因子：能自主转座，如,Ac,非自主性因子：不能自主转座，当基因组中存在与其同,家族的自主性因子时，才具备转座功能，如,Ds,十、转座子的应用,功能基因组研究,植物：转座子标签,-,拟南芥、水稻突变体库,动物：,PB,因子,-,小鼠突变体,十一、反转录转座子（,retrotransposon,）,转座经过,RNA,阶段。,DNA,元件转录成,RNA,，再,逆转录为,DNA,，然后插入基因组中某一新位点。,类似反转录病毒感染,果蝇,copia,，酵母,Ty1,，拟南芥菜,Ta1,Question,名词解释：,DNA,重组（遗传重组）、同源重组、转座、复制性转座、非复制性转座、反转座子,简答题：,1,、简述,RecA,、,RecBCD,的作用及细菌同源重组,的机制,2,、试述转座的机制和遗传学效应,思考题：转座子有哪些应用？,