分子生物学第九章 DNA重组技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章,DNA,重组技术,对多数生物来说，基因本质是,DNA，,基因工程就是要改建,DNA，,涉及,DNA,序列的重新组合和建造，所以基因工程的核心就是人工的,DNA,重组（,重组、建造的,DNA,分子只有纯化繁殖才有意义。纯的无性繁殖系统称为克隆。纯化繁殖,DNA,就称为,DNA,克隆或分子克隆，基因的纯化繁殖就称为基因克隆。所以,DNA,重组和分子克隆是与基因工程密切不可分的，是基因工程技术的核心和主要组成部分。重组,DNA、,分子克隆甚至成了基因工程的代名词。,基因工程属于生物技术范畴，广义的生物技术指任何利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物品质的技术；狭义的生物技术是专指以,DNA,重组技术和单克隆技术为标志发展起来的新技术。一般认为这新的生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术；细胞技术是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生物技术获得最终产品的手段，四个方面相互联系的。生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细胞融合技术最为突出。蛋白质工程则是在基因工程基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域，开创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的新时期，被称为第二代基因工程。,第一节工具酶,一、限制性核酸内切酶的概念,核酸酶可分为两类：核酸外切酶是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶则从核酸链中间水解3，5磷酸二酯键，将核酸链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身的,DNA,分解外来的,DNA,以保护和维持自身遗传信息的稳定。,二、限制性核酸内切酶的命名,按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌,d,株（,Haemophilus influenzae,d）,中先后分离到3种限制酶，则分别命名为,Hind、Hind,和,Hind。,三、限制性核酸内切酶的分类,按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类：,类限制性核酸内切酶由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于,ATP,的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的,DNA,序列位点，去随机切断在识别位点以外的,DNA,序列，通常在识别位点周围400-700,bp,。,这类酶的作用需要,Mg2+，S,腺苷甲硫氨酸及,ATP。,类限制性核酸内切酶与类酶相似，是多亚蛋白质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别序列周围25-30,bp,范围内，酶促反应除,Mg2+,外，也需要,ATP,供给能量。,类限制性核酸内切酶只由一条肽链构成，仅需,Mg2+，,切割,DNA,特异性最强，且就在识别位点范围内切断,DNA。,是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组,DNA,技术提到的限制性核酸内切酶主要指类酶而言。,四、限制性核酸内切酶的作用,大部分限制性核酸内切酶识别,DNA,序列具有回文结构特征，切断的双链,DNA,都产生5磷酸基和3羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种不同的情况：,产生3突出粘性末端（,cohesive end）:,以,Eoor,为例：,5,GAATT C35,Gp,OHTTAAC3,3C ATAAG5,EooP, 3CTTAAOH,pG,5,产生5突出的粘性末端：以,Pst,为例：,5,CTGCAG35,CTGCAp,OHG3,3GACGTC5,Pst, 3GOH,pACGTC,5,产生平末端（,blunt end）:,Nru,为例：,5,TCGCGA35,TCGp,OHCGA3,3AGCGCT5,Nru,3,AGCOh pGCT,5,DNA,重组技术中最常用的工具酶,酶,主要用途,限制性核酸内切酶,识别,DNA,特定序列，切断,DNA,链,DNA,聚合酶 或其大片段（,Klenow,）,缺口平移制作标记,DNA,探针 合成,cDNA,的第二链填补双链,DNA3,凹端,DNA,序列分析,耐热,DNA,聚合酶（,Taq,DNA,聚合酶,聚合酶链反应（,PCR）,DNA,连接酶,连接两个,DNA,分子或片段,多核苷酸激酶,催化多核苷酸5羟基末端磷酸化，制备末端标记探针,末端转移酶,在3末端加入同质多聚物尾,SI,核酸酶，绿豆核酸酶,降解单链,DNA,或,RNA，,使双链,DNA,突出端变为平端,DNA,端酶,降解,DNA，,在双链,DNA,上产生随机切口,RNA酶A,降解除,RNA,磷酸酶,切除核酸末端磷酸基,第二节重组,DNA,载体,理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求：,能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。,容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。,容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体,DNA,上要有合适的限制性核酸内切酶位点。,容易从宿主细胞中分离纯化出来， 这才便于重组操作。,有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。,一、质粒载体,质粒（,plasmid,）,是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下：,是染色质外的双链共价闭合环形,DNA（,cccDNA,），,可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300,kb,之间，15,kb,的小质粒比较容易分离纯化，15,kb,的大质粒则不易提取。,能自主复制，是能独立复制的复制子,。,一般质粒,DNA,复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。每个质粒,DNA,上都有复制的起点，的质粒的可以整合到宿主细胞染色质,DNA,中，随宿主,DNA,复制，称为附加体。,质粒对宿主生存并不是必需的。,质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，但也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称,R,质粒，带有,R,质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。,现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体，近年来发展很快，新的有特定用途的质粒不断被创建。图给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒,pUC19,的图谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频率起动质粒复制，使一个细菌,pUC19,的拷贝数可达500-700个。,二、噬菌体载体,噬菌体（,phage）,是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大，如,噬菌和,T,噬菌体等；有的则较小，如,M13、f1、,fd,噬菌体等。,噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约49,kb,的线性双链,DNA,分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。,噬菌体感染时，通过尾管将基因组,DNA,注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。,DNA,进入大肠杆菌后以其两端12,bp,的互补单链粘末端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖（图）：,溶菌性方式：利用宿主菌中的酶类和原料，,DNA,上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，,DNA,经多次复制合成许多子代,DNA，,于是装配成许多子代的,噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的,噬菌体。,溶原性方式,：,进入细菌的,DNA,可整合入细菌的染色质,DNA,中，随细菌染色体,DNA,复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质,DNA,中的,DNA,称为原噬菌体，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌,利用,噬菌体作载体，主要是将外来目的,DNA,替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。现在广泛使用的,噬菌体载体也是已作过许多人工改造的，主要的改造是：设计去除,DNA,上的一些限制性酶切点。这是因为,DNA,较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。在中段非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝白筛选,lacI,-,lacZ,序列，和多克隆位点等。由此可构建出两类,噬菌体作载体；一类是插入型载体，可将外来序列插中段，常用的,gt,系列载体，一般容许插入5-7,kb,外来,DNA；,另一类是转换型载体，即可用外来,DNA,替代中段，如,IMBL,系列载体。,三、动物病毒载体,感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前病毒载体常用者有改造来自猴肾病毒,SV40、,逆转录病毒和昆虫杆状病毒等，使用这些病毒载体的目的多为将目的基因或序列放入动物细胞中表达或试验其功能、或作基因治疗等,人基因组十分庞大，约含4109,bp,，,建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（,YAC）,载体应运而生。,YAC,含有酵母染色体端粒,、,着丝点及复制起点等功能序列，可插入长度达200-500,kb,的外源,DNA，,导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要载体。,第三节目的序列与载体的连接,一、粘性末端连接,如果目的序列两端有与载体上相同的限制性核酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端，在降低温度退火时，能重新互补结合，在,DNA,连接酶催化下，目的序列就与载体,DNA,链相连接（图:同一限制酶切割,DNA,粘性末端的连接）。,如果在连接的两个,DNA,片段没有能互补的粘性末端，可用末端核苷酸转移酶催化脱氨单核苷酸添加,DNA,的3末端，例如一般,DNA3,端加上,polyG,，,另一股,DNA,加上,polyC,，,这样人工,在,DNA,两端做出能互补的共核苷酸多聚物粘性末端，退火后能结合连接（图），这样方法称为同聚物加尾法。,二、平末端连接,T4DNA,连接酶也能催化限制性内切酶切割产生,DNA,平末端的连接。如果目的序列和载体上没有相同的限制性内切酶位点可供利用，用不同的限制性内切酶切割后的粘性末端不能互补结合，则可用适当的酶将,DNA,突出的末端削平或补齐成平末端，再用,T4DNA,连接酶连接，但平末端连接要比粘性末端连接的效率低得多。,对平末端的,DNA，,也可先连上人工设计合成的脱氧寡核苷酸双链接头，使,DNA,末端产生新的限制内切酶位点，经内切酶割后，即可按粘性末端相连（图:人工接头连接法）。,第四节目的基因序列的来源和分离,一、基因组,DNA,文库,从生物组织细胞提取出全部,DNA，,用物理方法（超声波、搅拌剪力等）或酶法（限制性核酸内切酶的不完全酶解）将,DNA,降解成预期大小的片段，然后将这些片段与适当的载体（常用噬菌体、粘粒或,YAC,载体）连接，转入受体细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组,DNA,片段与载体连接的重组,DNA,分子，而且可以繁殖扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各,DNA,片段克隆的集合体，就称为基因组,DNA,文库（,genomic DNA library）。,基因组文库是具有生物种属特异性的。,构建基因组文库，再用分子杂交等技术去钓取基因克隆的方法，称为鸟枪法或散弹射击法，意味着从含有众多的基因序列克隆群中去获取目的基因或序列。当生物基因组比较小时，此法较易成功；当生物基因组很大时，构建其完整的基因组文库就非易事，从庞大的文库中去克隆目的基因工程量也很大。,基因组,DNA,文库的构建,二、,cDNA,文库,提取出组织细胞的全部,mRNA,，,在体外反转录成,cDNA,，,与适当的载体常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段,cDNA,，,并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部,mRNA,信息的,cDNA,克隆集合称为该组织细胞的,cDNA,文库.,基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以,cDNA,文库具有组织细胞特异性。,cDNA,文库显然比基因组,DNA,文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组,DNA,文库获得的基因与从,cDNA,文库获得的不同，基因组,DNA,文库所含的是带有含子和外显子的基因组基因，而从,cDNA,文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的,cDNA,。,cDNA,文库的构建,三、聚合酶链式反应（,PCR）,如果已经知道目的基因的序列，就能很方便地用,PCR,聚合酶链式反应，从基因组,DNA,或,cDNA,中获得目的基因，可不必要经过复杂的,DNA,文库构建过程。,PCR,是70年代中期创立的技术，其基本原理如图所示。,四、人工化学合成,按人们设计好的序列一次合成100-200,bp,长的,DNA,片段已不成问题。可能用这些合成的片段组合连接成完整的基因。但目前人工合成基因最大的限制是人们并未掌握怎样的核酸序列能具有生命功能的规律，例如1,kb,长的,DNA,最通常编码功能蛋白质的基因长度就可以有10600种不同的序列，随意合成的,DNA,绝大多数肯定是不具有生物功能或无法知道它会有什么功能的，因而只能模仿自然界生物中已知的基因序列来合成，而化学合成这样长的基因,DNA,序列，其价格远高于用,PCR,法获得基因，所以目前很少全部用化学方法去合成基因。但人工设计化学合成核酸片段作为引物、接头等已经是分子生物学和基因工程中必不可少。,第五节基因序列导入细胞,一、转化,由于外源,DNA,的进入而使细胞遗传性改变称为转化，早在1943年，,Avery,等就发现有毒肺炎双球菌的,DNA,与无毒肺炎双球菌共培养后产生有毒性的肺炎双球菌后代的转化现象。但,DNA,进入细胞的效率很低，在分子生物学和基因工程工作中可采取一些方法处理细胞，经处理后的细胞就容易接受外界,DNA，,称为感受态细胞，再与外源,DNA,接触，就能提高转化效率。例如大肠杆菌经冰冷,CaCl2,的处理，就成为感受态细菌，当加入重组质粒并突然由4转入42作短时间处理，质粒,DNA,就能进入细菌；用高电压脉冲短暂作用于细菌也能显著提高转化效率，这称为电穿孔转化法,。,二、感染,噬菌体进入宿主细菌，病毒进入宿主细胞中繁殖就是感染（,infection）。,用经人工改造的噬菌体活病毒作载体，以其,DNA,与目的序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组,DNA,包装成有活力的噬菌体或病毒，就能以感染的方式进入宿主细菌或细胞，使目的序列得以复制繁殖。感染的效率很高，但,DNA,包装成噬菌体或病毒的操作较麻烦。,三、转染,重组的噬菌体,DNA,也可象质粒,DNA,的方式进入宿主菌，即宿主菌先经过,CaCl,2,、,电穿孔等处理成感受态细菌再接受,DNA，,进入感受态细菌的噬菌体,DNA,可以同样复制和繁殖，这种方式称为转染,。,M13,噬菌体,DNA,导入大肠杆菌就常用转染的方法。重组,DNA,进入宿主细胞也常用转染方式。最经典的是1973年建立的磷酸钙法，其利用的基本现象是：,DNA,如以磷酸钙-,DNA,共沉淀物形式出现时，培养细胞摄取,DNA,的效率会显著提高。用电穿孔法处理培养的哺乳类细胞也能提高细胞摄取,DNA,能力，但所用外加电场的强度、电脉冲的长度等条件与处理细菌者都很不相同。,第六节目的基因序列克隆的筛选与鉴定,目的序列与载体,DNA,正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一个载体只携带某一段外源,DNA，,一个细胞只接受一个重组,DNA,分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体,。,将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选是基因克隆的重要步骤。在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。,一、根据重组载体的标志作筛选,最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（,anpr,）、,抗四环素(,terr,)、,抗卡那霉素(,kanr,),等。当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体,DNA,的细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。,根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步细致的筛选。,二、核酸杂交法,利用标记的核酸做探针与转化细胞的,DNA,进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法是将转化后生长的菌落复印到硝酸纤维膜上，用碱裂菌，菌落释放的,DNA,就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落,DNA,上而不被洗脱。核酸探针可以用放射性核素标记，结合了放射性核酸探针的菌落集团可用放射性自显影法指示出来，核酸探针也可以用非放射性物质标记，通常是经颜色呈现指示位置，这样就可以将含有目的序列的菌落挑选出来。,三、,PCR,法,PCR,技术的出现给克隆的筛选增加了一个新手段。如果已知目的序列的长度和两端的序列，则可以设计合成一对引物，以转化细胞所得的,DNA,为模板进行扩增，若能得到预期长度的,PCR,产物，则该转化细胞就可能含有目的的序列。,四、免疫学方法,利用特定抗体与目的基因表达产物特异性结合的作用进行筛选。此法不是直接筛选目的基因，而是通过与基因表达产物的反应指示含有目的基因的转化细胞，因而要求实验设计要使目的基因进入受体细胞后能够表达出其编码产物。抗体可用特定的酶常用过氧化物酶、碱性磷酸酶等标记，结合酶标抗体处，酶可催化特定的底物分解而呈现颜色，从而指示出含有目的的基因的细胞集落位置。免疫学方法特异性强、灵敏度高，适用于从大量转化细胞集合体中筛选很少几个含目的基因的细胞克隆,。,五、,DNA,限制性内切酶图谱分析,这是在上述筛选后的进一步分析。目的序列插入载体会使载体,DNA,限制性酶图谱（,restriction map）,发生变化，例如一个长600,bp,的目的序列利用它两端的,EooR,I,和,SalI,切后的粘末端连接插入,pUC19,的多克隆点，则重组质粒就增大为3.3,kb，,用,Eoor,I,和,SalI,双酶切后会出现600,bp,和-2.7,kb,两个,DNA,片段，提取转化细菌的质粒,DNA,作酶切后做电泳观察其酶切图谱，就能分析得结果；如插入的目的序列中有其它限制性内切酶位点，也能在酶切电泳图谱上观察到。这就可以进一步鉴定重组体是不是所要的目的克隆。,六、核苷酸序列测定,所得到的目的序列或基因的克隆，都要用其核酸序列测定来最后鉴定。已知序列的核酸克隆要经序列测定确证所获得的克隆准确无误；未知序列的核酸克隆要测定序列才能确知其结构、推测其功能，用进一步的研究。因此核酸序列测定是分子克隆中必不可少的鉴定步骤。核酸序列测定的原理和方法在分子生物学研究方法中有详细的讲述。,第七节克隆基因的表达,克隆的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白质在医学上、以至在工业上都是很有应用价值的，可以克隆其基因使之在宿主细胞中大量表达而获得。,要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将它放入带有基因表达所需要的各种元件的载体中，这种载体就称为表达载体,。,克隆基因可以放在不同的宿主细胞中表达，可用大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、培养的哺乳类动物细胞、以至整体动物。对不同的表达系统，需要构建不同的表达载体。,几种常用的大肠杆菌表达载体,大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表达工具已有二十多年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。,真核表达载体至少要含两类序列：原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组,DNA,克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加,poly-A,信号序列、,mRNA,剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。,真核表达载体,pSV2-neo,8、,附,