实时荧光定量PCR的原理和应用课件

,3/28/2020,#,实时荧光定量,PC,R,的原理和应用,目录,实时荧光定量,P,CR,原理,P,CR,荧光标记 绝对定量和相对定量,实时荧光定量,P,CR,应用,实时荧光定量,P,CR,发展,d,i,gi,t,al,P,C,R,q,P,C,R,A,rray,实时荧光定量,PCR,原理,聚合酶链式反应,Poly,m,e,r,ase,chain,r,eaction,(,PCR),197,1年，,K,horan,a,提,出：经过,D,N,A变性,，,与合适引物杂交，用,DN,A聚合酶延伸引,物，,并不,断重,复该,过程,便可,克隆,tRNA 基因。,1,98,5,年,，美,国,PE,-,Ce,t,u,s,公,司的,Mul,l,i,s,等,人,发,明,了聚,合酶链,反,应,（,P,CR,） 基本原,理,是,在,试管中,模,拟,细,胞内的,DNA,复制 最初采用,E-,c,o,l,i,DNA,聚合酶进行,P,C,R,，,由,于该酶不耐 热，使,这,一,过,程耗时,，,费,力,，且易,出,错,耐热,D,N,A,聚合酶的应用使得,P,C,R,能高效率的进行，,随 后,P,E,-C,e,tus,公司推出,了,第,一,台,P,C,R,自动,化,热循环仪,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发 明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔 化学奖。,聚合酶链式反应,Poly,m,e,r,ase,chain,r,eaction,(,PCR),PCR,ATC,G,CG,AT,AGC,G,TA,GC,TGC,G,AC,CT,AGC,5,3,TAG,C,GC,TA,TCG,C,AT,CG,ACG,C,TG,GA,TCG,3,5,D,NA,解旋解链,结合引物,子链延长,PCR,ATC,G,CG,AT,AGC,G,TA,GC,TGC,G,AC,CT,AGC,5,3,TAG,C,GC,TA,TCG,C,AT,CG,ACG,C,TG,GA,TCG,3,5,D,NA,解旋解链,结合引物,子链延长,GGA,U,CG,5,5,AUC,G,CG,3,3,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,PCR,ATC,G,CG,AT,AGC,G,TA,GC,TGC,G,AC,CT,AGC,5,3,TAG,C,GC,TA,TCG,C,AT,CG,ACG,C,TG,GA,TCG,5,5,3,D,NA,解旋解链,结合引物,子链延长,TAG,C,GC,TA,TCG,C,AT,CG,ACG,C,T,GGA,U,CG,5,AUC,G,C,G,ATA,G,CG,TA,GCT,G,CG,AC,CTA,G,C,3,3,DNA,聚合,酶,DNA,聚合酶,PCR,原理,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时,间,（,m,i,n,）,温度,（,）,适,温延伸,3,高,温变性,1,低,温退火,2,重,复,1,3,步,25,3,0,轮,目,的,DN,A,片段,扩,增,10,0,万,倍,以上,DN,A,单,链,与,引物,复,性,DN,A,双,螺旋,DNA,2,变性 形成 条单链,子,链延伸,DN,A,加,倍,模板,DNA,第一轮扩增,第二轮扩增,第三轮扩增,第四轮扩增,第五轮扩增,实时荧光定量,PCR,在,P,C,R,反,应,体系,中,加入,荧,光基,团,，利 用荧,光,信号,累,积,实,时,监测,整,个,P,CR,进程，,最后,通过,标,准曲,线,对未,知,模板,进,行定,量分,析的,方,法。,实时荧光定量,PCR,和常规,PCR,常规PCR技术：,对PCR扩增反应的,终点产 物,进行定量和定性分析。无 法对起始模板准确定量，无 法对扩增反应实时检测。,实时荧光定量PCR技术：,利,用,荧光信号的变化实,时检测,PC,R,扩增反应,中,每一个,循环扩,增,产物量,的,变化,，,通,过,C,t值,和,标准曲,线,的分析对,起始模板,进行定量分析。,荧光,PCR,特点,灵敏度高,特异性强,全封闭PCR过程，无需后处理,即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量,定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品,可实现一管多检,仪器自动分析，更快获得结果,实时荧光定量,PCR,原理,实时荧光定量,PCR,原理,Ct,值的,定,义,：,PC,R扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定 的阈值时所经过的扩增,循环次数。,C(t),value,C,t,值的重现性,横轴：,PC,R,反映循环数,纵轴：荧光信号,量,Ct,值,的特,点,：,相同模板进行96次扩增,，,终点,处,产物,量,不 恒定；,C,t,值则极具重现性,实时荧光定量,PCR,原理,-,定,量,原理,理想的,P,CR反应：,X=,X,0,*2,n,非理想的,P,CR反应：,X=,X,0,(1+,E,x,),n,n：扩增反应的循环次数,X：第n次循环后的产物量,X,0,：初始模板量,E,x,：扩增效率,实时荧光定量,PCR,原理,-,定,量,原理,在扩增产物达到阈值线时:,X,C,t,=,X,0,(,1+E,x),C,t,=M,(,1),X,C,t,:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M,方程式,(,1,),两边同时取对数得: lg,M,=lg,X,0,(,1+E,x),Ct,整理方程式,(,2,),得:,(,2),lg,X,0,=,-,Ct,l,g(,1+E,x,),+,lg,M,(,3),Lg,浓度,与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到,域值,的循环,数即,Ct,值,就,可计算出样品中所含的模板量。,实时荧光定量,PCR,原理,-,定,量,原理,模板D,NA,量越多，荧光达到域值的循环数越少，即,Ct,值越小。,L,o,g,浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝 数的标准品可作出标准曲线，根据样品,Ct,值，就可以 计算出样品中所含的模板量。,4,0,3,9,3,8,3,7,3,6,3,5,3,4,3,3,3,2,3,1,3,0,2,9,2,8,2,7,2,6,2,5,2,4,2,3,2,2,2,1,2,0,1,9,1,8,1,7,1,6,1,5,1,1,0,10,0,100,0,1000,0,Cop,y,Num,bers,10000,0,100000,0,1000000,0,C(t,),Val,ue,St,andar,d,Cur,ve,实时荧光定量,PCR,原理,-,相,对,定量,X,Ct,=,X,0,(,1,+,E,x,),Ct,x,=,K,x,R,Ct,=,R,0,(,1,+,E,R,),Ct,R,=,K,R,X,Ct,R,Ct,R,0,(,1,+,E,R,),Ct,R,X,0,(,1,+,E,x,),Ct,x,K,=,x,=,K,K,R,=,X,0,R,0,(,1,+,E,),Ct,x,-,Ct,R,=,K,X,N,(,1,+,E,),Ct,=,K,X,N,=,R,X,0,0,E,x,=,E,R,=,E:,X,N,=,K,(,1,+,E,),-,Ct,X,N,q,=,K,(,1,+,E,),-,Ct,q,K,(,1,+,E,),-,Ct,c,b,=,X,N,c,b,(,1,+,E,),-,Ct,C,t=,C,t,q,-,C,t,cb,样本,q,的,X,N,除以,校准样本（,C,a,l,i,b,r,a,t,o,r,）,c,b,的,X,N,：,靶核酸： 参比内标：,C,t,=,C,t,x,-,C,t,R,：,实时荧光定量,PCR,原理,-,相,对,定量,L,i,v,a,k &,Sc,h,m,i,tt,gen,M,e,t,hod,2001,25,:,402,-,408,绝对定量和相对定量,绝对定量：精确的计算初始反,应,的模,板,浓度,（,DNA,，,RN,A,）,病毒,DNA,或,RNA,的拷贝数,转基因的拷贝数,相对定量：计算初始反应模板,的,相对,含,量,差异表达分析,芯片评估,转基因生物的检测,基因型检测,荧光标记,非特,异性,荧,光标,记,：,1、,S,YBR G,ree,n, 2、EvaG,reen,3、,L,CG,reen,特异,性荧,光,标记：,2、,T,a,qM,an,3、,M,ol,e,c,u,lar B,e,acon,4、,Amp,l,i,s,en,sor,R,QQ,SYBR,GR,EE,N,I,S,YBR G,reen,能结合到双链D,NA,的小沟部位,S,YBR,G,reen,S,YBR G,ree,n,只有和双链D,NA,结合后才发荧光,变性时，D,NA,双链分开，无荧光,复性和延伸时，形成双链D,NA,，,S,YBR G,reen, 发荧 光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。,SYBR,GR,EE,N,熔解曲线分析,将温度与荧光强度的变化求导。(-d,I/,d,T,),-dI,dT,T,m,SYBR,GR,EE,N,熔解曲线分析,融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确,融解曲线分析，有杂峰,其他产物出现非特异性 荧光，因此定量不准确,非特异,性产 物,SYBR,GR,EE,N,法优缺点,对D,NA,模板没有选择性,-适用于任何D,NA,使用方便,-不必设计复杂探针,非常灵敏,便宜,优点,缺点,容易与非特异性双链D,NA,结合，产生假阳性,但可以通过,融解曲线的分,析,，优化反应条件,对引物特异性要求较高,FR,E,T,当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基 团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长,（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转,移,(FRET),实际相当 于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。,T,aq,m,a,n,探针,与目标序列互补,5,端标记有报告基团(Re,p,o,r,te,r,R) ，如FAM、,V,I,C,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Que,n,c,he,r,Q),探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收,，无荧光，,R与Q分开，发荧光,（荧光共振能量转移原理，FRE,T,）,T,aq酶有,5,3,外切核酸酶活性，可水解探针,T,aq,m,an,探针,特异性荧光 双标记探针,Ta,q,酶,5,3,外切,酶活性,T,aq,m,an,探针法优缺点,对目标序列的高特异性,-阴性结果确定,设计相对简单,-与目标序列某一区 域互补,重复性比较好,优,点,只适合一个特定的目标,委托公司标记，价格较高,不易找到本底低的探针,缺,点,M,olecular,Beacon,分子信标,环,标记荧光的发夹探针,环与目标序列互补,茎由互补配对序列组成,茎,荧光素淬灭剂,M,olecular,Beacon,分子信标,M,olecular,Beacon,分子信标,高特异性,：,对目标 序列,检测,S,N,P,最灵敏的试 剂之一,荧光背景低,优,点,缺,点,只能用于一个特,定目标,设计困难,价格比较高,高分辨率熔解曲线,H,igh,resolution,m,elting,cure(,HR,M),R,ee,d,e,t,a,l,.,P,ha,r,m,a,c,ogeno,m,i,cs,(,2007,),8,(,6,),597,608,实时荧光定量,PCR,应用,实时荧光定量,PCR,应用,基因扩增,扩增特异性分析,基因定量分析,基因检测,基因分型,S,N,P,分析,R,F,L,P,多态性分析,单,/,多基因表达研究,高通量基因表达谱研究,疾病的早期诊断,免,疫学诊,断,主要是,抗,原抗体,反,应，应,用,于临,床,通常在,体,内产生,抗,体以后,，,而许多,病,原体,的,免疫学,检,测存在,较,长的“,窗,口期”,，,比如,HC,V,的,“,窗,口期”,平,均长达,70,天，不,利,于对疾,病,的早期,诊,断,；,PC,R,方,法,直,接,检测病,原,体的,DNA,/,RN,A,，,能大大,缩,短“窗,口,期”，,其,高灵敏,度,的检测,显,然也有,利,于疾病,的,早期诊,断,。,病,原体检,测,：确定,病,原体的,种,类和基,因,型，,以,利于治,疗,方案的,确,定,遗传疾病的早期诊断,荧光,P,CR,可实现对点突变、,缺,失突,变,、插入 突变、多基因突变等的检测，对产,前,诊断具,有其他方法不可比拟的优势，有利,于,优生优 育，提高人口素质。,药物研究,任何一种抗病毒药物，以免疫标志,物,来评价 其疗效均不够敏感和及时，若以病,毒,复制的 被抑制程度，即病毒基因水平的高,低,和动态 变化来评价疗效，则较为直接和理,想,。,新药筛选：药物作用靶标的研究，,基,因表达 的变化,药效的评价：对服药后体内基因表,达,或病原,体载量的变化进行监控，更好的评,价,药效， 有助于治疗方案的改进,肿瘤的诊断,可对原癌基因的突变和易,位,等作,出,检测；,可对原癌基因的,m,RN,A,进行,定,量分,析,；,有利于肿瘤的早期诊断，甚至,癌,前诊,断,；,探索癌变发生机理的研究提供,参,考；,区别肿瘤的良性和恶性以及炎,症,反应。,食品安全,病原微生物检测：对食品中可能存,在,的病原 微生物进行定量检测，保护人民生,命,安全,转基因食品检测,动物疫病检测：为防止动物疫病的,传,播和人 畜共患疾病的控制提供检测方法,实时荧光定量,PCR,发展,Digital,PCR,qPCR,A,rr,ay,qPCR,a,rr,ay,G,en,e,C,opon,i,ea,公司的,A,ll,-,i,n,-,O,n,e,T,M,H,u,m,an,W,ho,le,G,eno,me,mi,RN,A,Q,-,P,C,R,A,rray,O,r,i,gene,公司的,T,i,ssue,S,ca,n,T,i,ssu,e,q,P,C,R,A,rrays,SAB,i,osc,i,ences,公司的,R,T,2,P,ro,fil,er,T,M,P,CR,A,rra,y,S,ys,t,em,T,he,E,nd,T,hank,You!,实时荧光定量,PCR,原理,-,定,量,原理,可编辑,