第二章_电化学传感器的构成

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第二章 电化学传感器,1,第一节,电化学传感器概述,一、传感器基本概念,传感器,：,能感受（或响应）一种,信息,并变换成可测量信号的器件。,2,物理信息：光、声、温度、压力等,化学信息：组分、气味、味道等,物理传感器,化学传感器,化学传感器的检测对象：化学物质，要求对特定分子有选择性的响应。,化学传感器依据其工作原理可以分为：,电化学式,、光学式、热学式及质量式等。,3,二、电化学传感器工作原理,根据检测对象的不同可以分为：,离子传感器、气体传感器、生物传感器,根据工作方式的不同，可以分为,电位型,传感器、,电流型,传感器、,电导型,传感器,电化学传感器：由一个或多个能产生与被测组分某种化学性质相关电信号的敏感元件所构成的传感器。,4,被分析物,选 择 性 敏 感 膜,化学信息,换 能 器,电信号,二 次 仪 表,电化学传感器总工作原理：将被测物与敏感材料之间相互作用产生的化学信息转换成可测量的电信号。,5,1、电位型传感器工作原理,膜,电位,与溶液中待测离子活度（或浓度）的对数值呈线性关系 。,离子选择性膜中的离子与溶液中的离子发生交换反应，在两个界面处形成两个液接电位。,电位型传感器中，研究最多的是,离子传感器,，或称,离子选择性电极,。,6,2、电流型传感器工作原理,测量的电流信号与发生电极氧化（或还原）的物质浓度相关 。,通过测量,电流,或电量来测定化学量,通常采用,三电极体系,：工作电极、辅助电极、参比电极,7,3、电导型传感器工作原理,通过测量,电导,来测定化学量,惠斯顿电桥平衡法,电导型传感器有极高的灵敏度，但几乎,没有选择性,，因此应用较少。,8,三、电化学传感器的性能指标,电化学传感器的性能指标：,灵敏度,、,选择性,、,响应时间,、准确性、测量范围、温度系数、,背景电流和仪器噪声,、稳定性、使用寿命等。,各性能指标与敏感元件的本性、电极材料、制备工艺、信号收集与处理系统的性能等因素有关。,9,1、灵敏度,影响灵敏度的因素：,(1) 待测物在检测系统中的传质速度；,(2) 电极材料的电化学活性（包括电极材料、电极的物理形状和工作时的电极电势）；,(3) 反应过程中每摩尔物质传递的电流；,(4) 待测物在电解液中的溶解性和流动性；,(5) 传感器的几何形状和样品进入的方法；,(6) 膜电位的大小及达到平衡的时间长短；,(7) 工作电极产生的噪声信号大小。,10,2、选择性,对电位型传感器而言，选择性依赖于被测溶液和参比溶液之间膜电位的大小，膜电位要迅速达到平衡，只对所研究的离子有响应并随浓度线性变化；,对电流型传感器，工作时的电极电势和电催化剂的选择直接影响传感器的选择性。,选择合适的电解液和操作方法、加过滤器或选择渗透膜可提高传感器的选择性。,11,3、响应时间,对电位型传感器，响应时间取决于膜电位达到平衡的时间长短；,电流型传感器的响应时间在很大程度上取决于反应电阻和界面电容的时间常数。,4、背景电流和仪器噪声,背景电流产生原因：电解液或电极上的杂质；电极的腐蚀；反应物或对电极上的反应产物的扩散。,背景电流与仪器噪声影响传感器灵敏度。,12,第二节,离子传感器,离子传感器又称离子选择性电极，它是由敏感膜、内导体系、电极控件等部件组成，它能与溶液中某种特定的离子产生选择性的,响应,。,响应,是指离子选择性电极,敏感膜,在溶液中与特定离子接触后产生的膜电位值随溶液中该离子的浓度变化而变化。,13,将离子选择性电极与参比电极组成一个原电池，在零电流条件下测量原电池电动势，通过能斯特方程计算溶液中待测离子的活度。,一、离子传感器的基本结构,玻璃电极,硫化银膜电极,离子接触型,全固态型,14,二、离子传感器的分类,根据膜电极响应机理，膜的结构、组分对离子传感器分类：,基本传感器,晶体膜传感器,均相膜传感器,非均相膜传感器,非晶体膜传感器,带负电荷载体,流动载体传感器,带正电荷载体,敏化传感器,带中性载体,场效应半导体传感器,硬质传感器 （玻璃电极）,气敏传感器,生物敏传感器,15,1、晶体膜传感器,敏感膜是由难溶盐经过加压或拉制，制成单晶、多晶或混晶的活性膜。分为均相和非均相晶体膜两类。,均相膜：由一种纯固体材料单晶或单种化合物或集中化合物均匀混合压片制成的膜。,非均相膜：除了晶体敏感物外，还加入了高混合惰性载体，如聚氯乙烯、硅橡胶、石蜡等，以改善膜传感性能。,16,晶体膜传感器的品种和性能,传感器,膜材料,线性响应浓度范围,c/(mol,L,1,),主要干扰离子,F,LaF,3,Eu,2,5,10,7,1,10,1,OH,Cl,AgClAg,2,S,5,10,5,1,10,1,Br, S,2,O,3,2, I, CN, S,2,Br,AgBrAg,2,S,5,10,6,1,10,1,S,2,O,3,2, I, CN, S,2,I,AgIAg,2,S,1,10,7,1,10,1,S,2,CN,AgI,1,10,6,1,10,2,I,Ag, S,2,Ag,2,S,1,10,7,1,10,1,Hg,2,Cu,2,CuSAg,2,S,5,10,7,1,10,1,Ag, Hg,2, Fe,3, Cl,Pb,2,PbSAg,2,S,5,10,7,1,10,1,Cd,2, Ag, Hg,2,Cu,2, Fe,3, Cl,Cd,2,CdSAg,2,S,5,10,7,1,10,1,Pb,2, Ag, Hg,2,Cu,2, Fe,3,17,晶体膜电极由电极管、内参比电极、内充液和敏感膜四部分组成。,三种常见结构：带内参比溶液电极，无内参比溶液电极，复合电极。,带内参比溶液电极：,内参比电极一般是Ag|AgCl电极，内参比溶液一般由电极种类所决定，如氟电极，一般用NaF,18,无内参比溶液电极,：是一种全固态电极，内参比电极一般使用一根导体银丝直接与固态膜焊接，固态压片膜的一个表面加一层银粉，再将银丝焊接上去。,复合电极,：它与外参比电极组合成一个测量电池，测量时免去了常用分开的参比电极，结构更加紧凑。,复合电极的外参比电极,19,2、非晶体膜传感器,膜是由一种含有离子型物质或不带电荷的支撑体组成，这种支撑体是多孔性的膜或无孔的膜。膜电位是由于膜相中存在着离子交换而引起的。分为,硬质,和,流动载体,传感器。,硬质传感器的膜由具有离子交换功能的玻璃熔融烧制而成，又称为,玻璃电极,。玻璃敏感膜的组成一般为Na,2,O、SiO,2,、CaO和A1,2,O,3,等，根据其组分和含量的不同，玻璃电极可以响应不同的离子。,20,流动载体传感器：敏感膜是由某种有机液体离子交换剂制成，由电活性物质（载体）、溶剂（增塑剂）、基体（微孔支持体）组成。,l ：内充溶液,2,：,AgAgCl内参比电极,3,：,液体离子交换剂,4,：,浸有液体离子交换剂的多孔性膜,液体,离子交换剂与被测离子结合,，能在膜中迁移，溶液中,反号离子被排斥在膜之外,，引起相界面电荷分布不均匀，,形成界面电势差,。,21,常用流动载体传感器,传感器,活性物质,线性响应浓度范围,c/(mol,L,1,),主要干扰离子,Ca,2,二（正辛基苯基）磷酸钙,溶于苯基磷酸二辛酯,1,10,5,1,10,1,Zn,2, Mn,2,Cu,2,K,缬氨霉素,1,10,6,1,10,1,Cs, NH,4,水硬度,Ca,2,Mg,2,二癸基磷酸钙溶于癸醇,1,10,5,1,10,1,Na, K, Ba,2, Sr, Cu,2, Ni,2, Zn,2, Fe,2,NO,3,四（十二烷基）硝酸铵,5,10,6,1,10,1,NO,2, Br, I, ClO,4,ClO,4,邻二氮杂菲铁(II)配合物,1,10,5,1,10,1,OH,BF,4,三庚基十二烷基氟硼酸铵,1,10,6,1,10,1,I, SCN, ClO,4,22,三、离子传感器的响应机理,溶液中的离子与敏感膜上的离子之间发生交换作用,敏感膜内外离子活度差,敏感膜内外产生电位差,膜电位,M,对于阳离子：,对于阴离子：,23,四、离子选择性场效应晶体管型离子传感器,ISFET,是一种将离子选择性,敏感膜,与半导体,场效应器件,结合起来的微电子离子选择性敏感器件，其核心部件是场效应晶体管(FET),溶液中敏感,离子的活度,与,电位间,存在能斯特关系，而电位能控制场效应晶体管,漏电流,的变化，因此测定漏电流便可知离子的活度。,24,ISFET的主要特点：, 属于固态传感器，机械性能好、耐震动、寿命长；, 构造简单，体积小，便于批量制作，成本低，便于微型化；, 适应温度范围宽；, 输出阻杭低，与检测器的连接线甚至不用屏蔽，不受外来电场干扰，测试电路简化；, 可在同一硅片上集成多种传感器，对样品中不同成分同时进行测量分析。,25,第三节 电化学,气体传感器,气体传感器：能,感知,环境中,某种气体及其浓度,的一种装置或器件，它能将气体种类和浓度有关的信息转换成可测量的信号。,电子鼻,是一种20世纪90年代发展起来的新颖的分析、识别和检测复杂嗅味及大多数挥发性成份的仪器，是由一定选择性的传感器阵列和适当的图像识别装置组成的仪器，能够识别单一的或复合的气味；是模拟动物嗅觉器官开发出一种高科技产品。,26,气体传感器有,电化学型,、光学型、半导体型、热导型、表面声波型等种类。,电化学气体传感器优点：能满足一般检测所需要的灵敏度和准确性，体积小、操作简单、携带方便、,可用于现场监测,，价格低廉。,电化学气体传感器按照工作原理分为,电位型气体传感器,、,电流型气体传感器,（又称控制电位电解型气体传感器）等 。,27,一、电流型电化学气体传感器,1、Clark电极（溶解氧电极）,Clark电极是一种测定溶解在液体中的氧的电流型电极，最早由Clark在1956年发明。,Clark电极是一种封闭式电极，它用一疏水,透气膜,将电解池体系与待测体系分开。待测的氧可以通过透气膜扩散到电极内，而待测溶液中的其他杂质不能透过，这样可以有效地防止电极被待测溶液中某些组分污染而中毒。,28,绝缘材料,Ag/AgCl参比电极,电解质溶液,透氧膜,氧气进入膜后在电极表面迅速还原，外电路检测的氧气,还原电流正比氧气的浓度,。,双层膜,：,透气膜,（将电极、电解液与待测溶液分开）；,液膜,（在透气膜与电极之间很薄的由电解液形成的，约515,m）。透气膜多为聚四氟乙烯膜。,29,Clark电极被广泛应用于水质处理、水文监测、污水处理、游泳池、鱼塘和化肥、化工、生物等领域的含氧量监测，测定水中溶解氧以研究光合、呼吸作用等。,优点,：稳定性好，膜不易损坏、抗污染 。,缺点,：传感器的响应时间较长（气体扩散到电极表面的速度很慢，气体在液膜中的扩散为整个电极过程的控制步骤 ），响应信号低，温度系数大。,30,2、CO气体传感器,工作原理：待测物的浓度（压力）与所产生的电流信号成线性关系。,31,CO传感器工作过程：,(1) 被测,气体进入传感器的气室,。自由扩散或机械泵入。气体先经过滤器：保护传感器（滤掉被测气体中的颗粒），提高选择性（滤掉电活性干扰物）。,(2) 反应物从气室到达多孔膜，并,向电极一电解液界面扩散,。多孔膜作用：防止传感器的漏液现象、进一步提高选择性。,(3),电活性物质在电解液中的溶解,。物质穿过气液界面的速度和气体在电解液中的溶解速度决定传感器的响应灵敏度和响应时间。,32,(4),电活性物质在电极表面吸附,。,(5),扩散控制,下的,电化学反应,。,当被测气体为CO，对电极为空气电极时：,工作电极：COH,2,O,CO,2,2H,2e,对电极：1/2 O,2,2H,2e,H,2,O,总反应：CO 1/2 O,2,CO,2,扩散控制下的电流i和溶液中被测物质的浓度成正比关系：,A,为电极面积，,D,为氧化态物种的扩散系数，,t,为反应时间，,n,为电极反应电子的计量系数。,33,(6),产物的脱附,。 如果产物解吸速度很慢，电极可能会中毒。,(7),产物离开电极表面的扩散,。,(8),产物的排除,。净化传感器内部空间。如果产物极易溶于电解液，将使传感器内部成分改变，传感器的信号响应则改变。CO传感器用酸性电解液。,影响传感器的响应特性的因数：,进样速度、工作电极成分、电解液的类型与用量、膜的孔积率和渗透力、工作电极的电位,等。,34,电化学CO气体传感器结构：电极、过滤器、透气膜、电解液、电极引出线（管脚）、壳体等。,CO气体传感器与报警器配套使用，是报警器中的核心检测元件。当一氧化碳扩散到气体传感器时，其输出端产生电流输出，提供给报警器中的采样电路，经报警器的中间电路转换放大输出，以驱动不同的执行装置，完成声、光和电等检测与报警功能。,35,3、电流型气体传感器优缺点,优点,：检测气体种类多，测量浓度范围宽，精度高，便于携带，可用于现场直接监测。,不足,：电解液的蒸发或污染导致传感器信号衰减，,使用寿命短,；催化剂长期与电解液直接接触，使,催化活性降低,；在干燥的气氛中，传感器中的,电解液很容易失水,而干涸，致使传感器失效；容易,发生漏液现象,，腐蚀电子线路；传感器的,微型化困难,。,36,二、固体电解质气体传感器,固体电解质类型：,高温陶瓷型,、快离子导体类、高聚物。,氧化锆固体电解质氧气传感器原理：,稳定化的二氧化锆对氧离子具传导性。,稳定化的 ZrO,2,：ZrO,2,中分别加入1015（摩尔比）CaO和Y,2,O,3,并使之固溶。该物质具有大量由氧气逸出而形成的,离子性晶格缺陷,，在500600,o,C以上形成,氧离子选择性透过,的离子导体。,37,氧化锆,Pt,Pt,V,P,(O,2,),待测气体,P,(O,2,),基准气体,氧传感器构成：氧化锆固体电解质为薄膜，两边安装上多孔性铂电极。,若两侧氧分压不同，则氧气从高压一侧透过氧化锆薄膜向低压一侧扩散，在薄膜两侧会产生电势差，即构成膜电势：,38,三、湿敏传感器,某些敏感材料能产生与,湿度,（水蒸气含量）有关的物理效应或化学反应，将湿度的变化转换成某个,电信号（,电阻、电容值等）。,1、高分子电阻湿敏传感器,高分子电解质感湿材料吸收水分后引起两电极间电阻的变化，将相对湿度的变化转换成电阻的变化。,组成：感湿层、电极和具有一定机械强度的绝缘基片等。,39,2、高分子电容湿敏传感器,当环境相对湿度增大时，环境气氛中的水分子沿着电极的毛细微孔进入感湿膜面被吸附，使两块电极之间的介质相对介电常数大为增加，所以电容量增大。,组成：在微晶玻璃衬底上，利用具有很大吸湿性的绝缘材料作为电容传感器的介质，在其两侧面镀上多孔性电极 。,优点：测全湿范围的湿度，线性好，重复性好，滞后小，响应快，尺寸小。,40,3、半导体陶瓷湿敏传感器,当环境湿度发生改变时，多孔感湿陶瓷吸湿，电阻值随之变化。,组成：由多孔感湿陶瓷薄片的两面加上两个电极，再焊出引线；外面围绕镍镉加热丝，并由引脚引出；把它们固定在绝缘陶瓷底座上 。,注意：为了防止电阻极化，测量时必须是交流；在高温、高湿环境下，要定期加热清洗，使传感器恢复性能。,41,第四节,电化学生物传感器,一、生物传感器,将生物体的成份（酶、抗原、抗体、DNA等）或细胞、组织固定化在载体上作为,敏感元件,的传感器称为生物传感器。,生物分子识别元件,（感受器）：具有分子识别能力的生物活性物质（如组织、细胞、细胞器、细胞膜、酶、抗体、核酸等）。,信号转换器,：电化学传感器、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等。,42,放大,换能器,接受器,信号测量,生物传感器原理,敏感元,生物催化反应专一性,生物传感器具有良好的选择性,43,生物传感器优点,1、选择性好，,样品不需预处理，测定时一般不需另加其它试剂。,2、体积小，可实现连续在线监测。,3、响应快、样品用量少；,且由于敏感材料是固定化的，可以反复多次使用。,4、,传感器连同测定仪的,成本,远,低,于大型的分析仪器，因而便于推广普及。,44,生物传感器的应用,生物传感器,生物医学,体育运动,食品,和药物,分析,军事,环境检测,45,生物传感器分类,抗原或抗体,免疫传感器,细胞传感器,微生物传感器,组织传感器,酶传感器,酶,微生物,细胞,组织,半导体传感器,测热型传感器,光学传感器,测声型传感器,电化学传感器,敏感元,按敏感材料分类,按信号转换器分类,信号转换器,电化学装置,场效应管,光纤,热敏电阻,SAW装置,电化学传感器,酶传感器,可交叉,46,二、电化学生物传感器原理,待测物,敏感物,固定载体,电极,物理、化学变化,电信号,信号测量,信号处理,敏感元,生物电极,电流法,电位法,安培法,47,生物分子固定方法,关键因素,生物分子固定材料,生物电极的构筑,吸附、包埋、交联、化学键合,无机材料、有机材料、复合材料,48,保持生物分子的催化,活性,和,专一性,生物分子,与载体,结合牢固,固定化,生物分子,要有最小的,空间位阻,载体要有一定的,机械强度,载体,稳定,，不可与底物、产物反应,载体具有,生物相容性,1、生物分子固定化方法与载体选择原则,三、生物分子固定化,49,2、生物分子常规固定化方法,吸附法,包埋法,共价结合法,交联法,50,（1）吸附法,通过载体表面和生物分子表面间的,次级键相互作用,而达到固定目的的方法。,将生物分子溶液与具有,活泼表面,的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的生物分子。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。,51,根据吸附剂的特点又分为：,物理吸附法,：,通过氢键、疏水键,、,电子亲和力,等物理作用力将生物分子吸附于不溶性载体。,常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等,无机吸附剂,，,纤维素、胶原以及火棉胶等,有机吸附剂,。,离子结合法,：,在适宜的pH和离子强度条件下，利用生物分子的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到固定化。,最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。,离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。,52,影响生物分子在载体上吸附程度的因素:,1.,pH,：影响载体和生物分子电荷,从而影响吸附。,2.,离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。,3.,生物分子浓度,：若吸附剂的量固定，随生物分子浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。,4.,温度,：生物蛋白往往是随温度上升而减少吸附。,5.,吸附速度,：生物蛋白在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。,6.,载体,：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。,53,吸附法的优点：,操作简单，,条件温和,，,可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化生物蛋白使用失活后可以重新活化和再生。,吸附法的缺点,：,生物分子与载体的结合力不强,，易脱落，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。所得到的传感器稳定性、,重现性差，灵敏度低,、使用寿命短。,吸附法的优缺点,54,（2）包埋法,将载体（聚合物等）与生物分子溶液混合，借助物理作用，生物分子被包埋在载体中以达到固定化。包埋法操作简单，由于生物分子只被包埋，未发生化学反应，可得高活力的固定化生物蛋白。对大多数生物分子甚至完整的微生物细胞都适用。,55,包埋法包括凝胶包埋法和微囊化包埋法：,凝胶包埋法（胶格包埋法）：将生物分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。,聚丙烯酰胺,包埋法 ：丙烯酰胺单体、交联剂和蛋白混合，然后加入催化剂使之开始聚合，结果就在生物分子周围形成交联的高聚物网络。,海藻酸钠,也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca,2+,、Al,3+,凝胶化 。,K-角叉莱胶,（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的蛋白回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。,明胶、壳聚糖,等,也是常用的包埋载体。,56,微囊化包埋法：将生物分子包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。,它使蛋白存在于类似细胞内的环境中，从而增加了生物分子的稳定性。,界面沉淀法,是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将蛋白包埋。,界面聚合法,是用化学手段制备微囊的方法。他所得的微囊外观好，但不稳定，有些生物分子还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。,表面活性剂乳化液膜包埋法,是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。,57,包埋法的优点：,是一种反应条件温和、很少改变生物蛋白结构但是又较牢固的固定化方法。,包埋法的缺点：,只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的生物蛋白并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化生物分子动力学行为改变，使活力降低。,包埋法的优缺点,58,（3）共价结合（偶联）法,生物蛋白分子上的功能基团和固相支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将生物分子固定在支持物上,（,借助共价键将生物蛋白的非活性侧链基团和载体的功能基团进行偶联）,。,59,共价偶联法操作原则：,（ a ）,载体,的物化性质要求载体,亲水,，并且有一定的,机械强度,和,稳定性,，同时具备在温和条件下与生物分子结合的,功能基团,。（ b ）偶联反应的,反应条件,必须在,温和pH,、,中等离子强度,和,低温,的缓冲溶液中。（ c ）所选择的偶联反应要尽量考虑到对蛋白的其它功能基团,副反应尽可能少,。（ d ）要考虑到蛋白固定化后的,构型,，尽量减少载体的,空间位阻,对蛋白活力的影响。,60,生物蛋白可提供的与载体连接的功能基团：,蛋白N端的氨基；,蛋白C-端的羧基以及Asp残基的-羧基和Glu残基-羧基；,Cys残基的巯基；,Ser、Tyr、Thr残基的羟基；,Phe和Tyr残基的苯环；,His残基的咪唑基；,Trp残基的吲哚基。,在实际中偶联最普遍的基团是：,氨基、羧基、,苯环。被偶联的基团还应是生物分子活性的非必需基团，否则将导致生物蛋白失活。,61,共价偶联法,载体的选择的一般要求:,一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化生物分子活力及其稳定性上都优于疏水载体。,载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。,载体必须有在温和条件与生物蛋白共价结合的功能基团。,载体没有或很少有非专一性吸附。,载体来源容易，能反复使用。,62,偶联反应：,缩合反应,：一些带羧基或氨基的载体用碳化二亚胺活化后，与生物蛋白分子的氨基或羧基直接偶联。,酸酐反应,：在己二胺作用下，酸酐与生物蛋白的氨基起偶联反应。,重氮反应,：将带芳香族氨基的载体，先用,NaNO,2,和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，,再与生物蛋白发生偶联。,异硫氰酸反应,：含有芳香氨基的载体，与光气反应生成异硫氰酸，再与酶分子的氨基连接。,活化酯法,：含羧基的载体在二环己基碳二亚胺存在下用,N,羟基琥珀酰亚胺活化，再连接生物蛋白。,酰氯化反应,：含羧基载体，用氯化亚砜处理，生成酰氯衍生物，再与蛋白的氨基偶联。,63,共价偶联法的优点,：通过键的形成将生物分子固定于固体表面，不易发生分子的泄漏，并且改善了生物分子在表面的定向、均匀分布状况。得到的固定化蛋白结合牢固、稳定性好、利于连续使用。,共价偶联法的缺点,：,载体活化的操作复杂、耗时，反应条件激烈；生物分子易失活，共价结合会影响到蛋白的空间构象，对蛋白的催化活性产生影响。,共价偶联法的优缺点,64,（4）交联法,利用双功能或多功能试剂在生物分子间或生物分子与载体间，或生物分子与惰性蛋白间进行交联反应，,得到三维网状结构。,交联试剂：,戊二醛,、,苯基二异硫氰,等。,65,（a）,直接交联法,在生物分子溶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于生物分子与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。,交联法种类,（b）,载体交联法,用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中的另一部分功能基团偶联生物蛋白。,66,（ c ）,辅助蛋白交联,当可得到的蛋白量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使蛋白共交联。这种“载体”蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。,（d）,吸附交联法,先将蛋白吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。,67,交联,法的优缺点,交联,法,的优点,：通过化学键将生物分子固定于固体表面，不易发生分子的泄漏。,交联,法,的缺点,：,反应难以控制，形成的蛋白质层蓬松、坚固性差，所需生物样品量多。,单用,交联,法制备的固定化生物蛋白活力较低，常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化蛋白的活力，又起到加固的效果。,68,物理吸附,包埋法,共价结合法,共价交联法,制备,易,易,难,难,结合力,弱,强,强,强,酶活力,高,高,中,中,底物专一性,无变化,无变化,有变化,有变化,再生,可能,不可能,不可能,不可能,固定化费用,低,中,高,中,制法,特性,（5）四种固定化方法的特点小结,新方法：自组装法、LB膜法、电化学法、多方法复合等,69,3、生物分子固定的载体材料,无机材料,聚合物材料,成膜性,不好,好,渗透性,好,一般,固定量,较高,一般,对酶影响,基本不影响酶结构,基本不影响酶结构,结合力,一般不高,一般较高,无机、聚合物复合材料可改善固定化生物分子的性能,70,4,、生物分子固定化发展方向,优越的固定材料,优异的固定方法,突破瓶颈,拓展应用,71,四、电化学酶传感器,电化学酶传感器是由,固定化酶,与,电化学传感器,组合而成的生物传感器。,酶具有,高效催化性,和,高度专一性,，使得传感器具有高度的选择性。,电化学酶传感器,选择性高,、,响应快,、灵敏度高、操作简便，能快速测定试液中某一给定化合物的浓度，且,需样品量很少,。,1、电化学酶传感器特点与分类,72,依据酶与电极之间的电子传递机理，将酶传感器分为三代：,根据电化学测量信号，酶传感器主要分为,电流型,和,电位型,。,73,2、电流型酶传感器,将酶促反应产生的物质在电极上发生氧化或还原反应产生的电流信号，在恒电位下，所测,电流,信号与,被测物浓度,呈,线性关系,。,测定对象,酶,基本传感器,葡萄糖,葡萄糖氧化酶,O,2, H,2,O,2,半乳糖,半乳糖氧化酶,O,2, H,2,O,2,尿酸,尿酸酶,O,2, H,2,O,2,乳酸,乳酸氧化酶,O,2, H,2,O,2,胆固醇,胆固醇氧化酶,O,2, H,2,O,2,L,氨基酸,L,一氨基酸氧化酶,H,2,O,2, I,2, O,2,单胺,单胺氧化酶,O,2,苯酚,酪氨酸酶,醌,乙醇,乙醇氧化酶,O,2,，,H,2,O,2,74,生物分子识别元件：,葡萄糖氧化酶膜,可测量：,O,2,的减少量，葡萄糖酸或,H,2,O,2,产生量,（1）葡萄糖传感器,75,H,2,O,2,O,2,2e,-,O,2,Glucose,Glucnolactone,GOD,Electrode,Biomembrane,Solution,E=,0.6 V,H,2,O,2,氧化产生的电流与葡萄糖浓度成正比。该方法灵敏度高，其最低检出限达10 nM。但工作电位较高，电活性物质（维生素C、尿酸等）产生干扰。,76,生物分子识别元件：,乙醇氧化酶膜,可测量：,O,2,的减少量，H,2,O,2,产生量,（2）乙醇传感器,生物分子识别元件：,乙醇脱氢酶膜,可测量：Ox,电子传递介质（二茂铁、四硫富瓦烯等）,77,（3）酚传感器,PPO,O,2,Electrode,2,e,-,-0,.2 V,Biomembrane,Solution,OH,OH,O,O,OH,OH,78,3、电位型酶传感器,将酶促反应所引起的物质量的变化转变成电位信号输出，,电位,信号大小与,底物浓度的对数,值呈,线性,关系。,基本传感器：,pH电极,、,气敏电极,（CO,2,、NH,3,）等，直接影响酶电极性能。,例：尿素传感器,常用氨敏电极测定，用于临床全血、血清、尿液等样品中尿素含量的测定及尿素生产线监测分析。,79,五、 电化学DNA传感器,基因传感器 包括,DNA生物传感器,和RNA生物传感器两大类,电化学DNA传感器根据工作原理的不同可分为,电流型,、电致化学发光型及电导型等,根据信号转换器的不同，基因传感器可分为电化学型、光学型和质量型等。,电流型DNA传感器由DNA片断电极和电活性指示剂构成。利用电活性分子来指示杂交前后信号变化，选择性地识别DNA 。,80,（1）电流型DNA传感器的基本结构及工作原理,活化,固定单链DNA,引入,电化学活性标识物,杂交反应电化学检测,81,（2）电化学活性识别物类型,以电化学活性的杂交指示剂作为识别物。杂交指示剂与电极表面的,形成复合物，通过测定其氧化还原峰电流和峰电位可以识别和测定,DNA,分子。,寡聚核苷酸上修饰电化学活性的官能团作为识别物。,利用酶的化学放大功能在,DNA,分子上标记酶作为识别物。,82,（3）电化学DNA传感器的应用,基因分析。,用于特定基因的检测，具有简便、快速、成本低等优点。,药物分析,。利用药物与核酸之间存在可逆作用。,环境污染监测中的应用,。受感染微生物的核酸序列分析、微量污染物的监测；研究污染物与,DNA,之间的相互作用，解释污染物毒性作用机理。,83,第五节 超微,电极,超微电极：电极的一维尺寸为微米或纳米级,一、超微电极的电化学特性,超微电极固有的很,小的,RC,时间常数,(,s,),使之可以用来对快速、暂态电化学反应进行研究，在扫描伏安测量中，,扫描速率高,达,2,10,4,V,s,1,，比常规电极快,3,个数量级。,超微电极上的物质,扩散极快,，可以用稳态伏安法测定快速异相速率常数。,84,超微电极的,极化电流很小,（,nApA,级），降低了体系的,IR,降，使之可以用于高电阻的体系中，包括低支持电解质浓度甚至无支持电解质溶液、气相体系、半固态和全固态体系；,可采用双电极体系,（参比电极兼作辅助电极），简化了实验方法及实验设备，提高了测量系统的信噪比。,超微电极小的尺寸确保在,实验过程中不会改变或破坏被测物体,，使得超微电极特别,适用于生物活体检测,。,85,二、超微电极结构,制备技术：光刻、超细纤维等,超微电极类型：圆盘、圆环极、圆柱、球形、半扁球、带状、阵列型、叉指形电极,制备材料：碳纤维、铂、金、铜、钨等,碳纤维超微电极的结构示意图,86,三、超微电极在生物细胞体内检测中的应用,脑神经组织中多巴胺、儿茶胺的实时监测。,单细胞检测,87,四、超微修饰电极,通过在超微电极表面的分子修饰，可按意图给电极预定功能，以便选择性地测定。,例：在超微电极上修饰Nafion膜，可有助于排除其他生物物质的干扰，对神经递质多巴胺进行选择性的测定，同时借助超微电极的特性，降低样品的检测限，将生物物质的分析提高到细胞水平 。,例：用组合式超微修饰电极可进一步放大电信号，提高灵敏度。,例：采用碳纳米材料可直接构筑,纳米电极,或纳米修饰电极，可实现信号放大，用于痕量物质的测定。,88,作业：,阅读,近三年来的相关文献,，了解某一,电流型生物传感器,：,（1）,测定原理,（2）,至少举出5例,：详细说明,生物电极构筑方法,（包括固定材料和固定方法）；列表说明相应的,传感器性能,（包括灵敏度、检测限、稳定性、响应时间等）,（3）该生物传感器的可能的,应用领域和前景,。,要求：,制作PPT，分组汇报,；,列出所阅读的参考文献,。,89,分组及汇报主题：,第一组：学号尾数为1、2的同学，,酚,传感器,第二组：学号尾数为3、4的同学，,尿酸,传感器,第三组：学号尾数为5、6的同学，,胆碱,传感器,第四组：学号尾数为7、8的同学，,黄嘌呤,传感器,第五组：学号尾数为9、0的同学，,乳酸,传感器,每组选,一名同学汇报,，并在最后一页给出,各组员对作业的贡献。,周日前将PPT上传到网络平台。,90,