第一部分 第一章植物组织培养实验室构建与操作技术001

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第一部分 第一章植物组织培养实验室构建与操作技术001,实验室设计原则,：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。,实验室的大小应取决于工作的目的和规模,按组织培养流程来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱,利用,一,定的设备、器材和特殊的实验室结构设计，达到严格无菌的条件,第一节植物组织培养实验室及主要设备,一、实验室设计与设备,组培的常见技术路线：,外植体愈伤组织不定芽生根再生植株,基本的工艺流程：,容器具洗涤，物质准备配置培养基并灭菌外植体消毒与无菌操作接种观察、记录、处理（脱分化、再分化、继代） 再生植株,标准,的组培实验室,洗涤室、准备室、无菌室、培养室、观察室等,基本,组培实验室,准备室,（含配药室）、,缓冲间,、,无菌操作室,、,培养室,功能：,进行一切与实验有关的准备工作,器皿洗涤、药品的配制,培养基配制与分装,培养基和培养器皿的灭菌,培养材料的预处理等,要求：,明亮、通风,便于多人同时工作,地面应便于清洁，并应进行防滑处理,1、准备室（化学实验室）,准备室主要仪器设备：,工作台,药品柜,冰箱,普通冰箱、低温冰箱等。主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。,天平,感量,的分析天平、感量,的电子天平（用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品）、感量为,的,托盘天平（用于称取用量较大的糖和琼脂等）,放置在水平、干燥、不受震动的操作台上,(5),恒温水浴锅,(6),蒸馏水发生器,蒸馏水用于配制母液或培养基（普通实验可以用自来水代替蒸馏水）,(7),电炉,(8),高压灭菌锅,进行培养基、水和器械用具的灭菌,不锈钢蒸馏水器（单蒸水）,(9),酸度计,测定培养基及酶制剂的,pH,值（普通实验,可使用pH试纸）,(10),烘箱,干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌 和测定干物重,(11),摇床,振荡培养,(12),离心机,分离培养基中的细胞以及解离细胞壁后的原生质体,PHS-802中文台式酸度计,通用型或经济型酸度计,全温型恒温培养摇床,多振幅高速轨道摇床,、缓冲室（注意门的朝向）,工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩,功能,减少人体从外界带入的尘埃等污染物。,要求,缓冲间需,3-5,平方米，应保持清洁无菌；,有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；,1-2,盏紫外灯定时照射，对衣物及空间进行灭菌。,、无菌操作室（接种室）,功能,外植体消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备等,要求,环境干爽，清洁，居于上风位,空间宜小不宜大,地面、天花板及四壁密闭光滑，无卫生死角,室内物品越少越好，尽可能减少空气流动,维护方法,定期消毒（紫外线照射、气雾熏蒸、药品喷洒）,及时维护（干燥、洁净）,接种室主要设备及用具,接种箱,主体为玻璃箱罩、入口有袖罩,超净工作台,操作台面半开放，方便、操作舒适；通过过滤的空气连续不断吹出，大于直径的微生物很难在工作台的操作空间停留,解剖镜,分离微茎尖、转基因等,无菌操作用的器具,酒精灯、镊子、解剖刀，解剖刀片、剪刀、培养瓶，刀剪架等,、培养室,功能,接种的材料进行培养生长的场所,（其设计以充分利用空间和节省能源为原则）。,要求：,能控制光照和温度,保持相对的无菌环境,有排风窗和换气扇等培养室的换气装置,有适宜的培养架，日光灯照明。,主要设备,培养架、培养箱、空调机、除湿机、换气扇、臭氧发生器等。,小型臭氧发生器,二、培养器皿及用具,1、培养器皿,（包括,玻璃,器皿和,塑料,器皿）,各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。,2、微孔过滤器,（细菌过滤器）,微米，抽滤灭菌用，如激素,3、器械用具,镊子、剪刀、解剖刀、接种针（铲）等。,第二节培养基及其配制,定义：,培养基(culture medium),根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的,人工制作,的营养物质。,是植物组织培养的,重要基质,。,不同植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同,没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官,找到一合适的培养基，是培养成功的基础。,一培养基成分,主要为：,水,无机盐,有机化合物,生长调节物质,培养体的支持材料,水,水是植物体的重要组成成分，是一切代谢过程的,介质和溶媒,，是生命活动过程中不可缺少的物质。,培养基大部分是水（,固体培养基 约,7580%,）,天然水或自来水,不能,直接用于,培养基配制,原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用,双蒸水或超纯水,。,大批量快速繁殖培养，可用单蒸水或纯净水。,保持母液及培养基成分的精确性,防止贮藏过程发霉变质,无机盐类(inorganic element）,离体组织生长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为：,大量元素,微量元素,大量元素,指植物所需元素的浓度,大于,L,的元素，有,C,、,H,、,O,、,N,、,P,、,K,、,Ca,、,Mg,、,S,。,除,C,、,H,、,O,外，其它矿质元素通常以一定浓度的,无机化合物,形式，按一定比例配制而成，溶于水中以离子态被吸收,N,有,硝态氮,KNO,3,和,铵态氮,(NH,4,),2,SO,4,两种形式（,一般,NH4N,对植物生长较为有利,）。,微量元素,浓度小于L的元素，有,Fe、Cu、Zn等。,铁盐在合成叶绿素中起重要作用，缺铁影响到胚的发育，阻碍子叶变绿。,(organic compound),基本,培养基（,只含有大量和微量元素）,为使培养物的生长更好，还需添加各种有机成分：,糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸,等,（）糖类（碳水化合物 ）,碳源，维持培养基的渗透压在。多使用,蔗糖,。,不同浓度会影响细胞的增殖分化，试管苗生长与繁殖浓度,2-3%,，幼胚培养,4-6%,，某些特殊培养中用,8-10%,。,细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖,（）维生素,明显的,促进,离体培养物的,生长,。,盐酸硫胺素-,VB1,、盐酸吡哆醇-,VB6,、烟酸、生物素、抗坏血酸-,Vc,等。,一般用量为L。,（）肌醇,（环己六醇）,促进,胚状体和芽的形成,。用量一般50-100mg/L。,（4）氨基酸,常用甘氨酸和多种氨基酸混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋白）,用量在10-1000mgL之间。,（,营养丰富，极易引起污染,，如在培养中无特别需要，以不用为宜。）,（,）,天然复合物（包括部分蛋白质水解物）,其,成分比较复杂,，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。,对细胞和组织的,增殖与分化,有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。,成分大多不清楚，一般尽量避免使用。,椰乳,使用最多、效果最大。用量为,10%20%,（愈伤、细胞培养）。,香蕉汁,用量为,150-200ml,L,，缓冲,pH,值（兰花组培）。,马铃薯,用量为,150200g,L,，缓冲,pH,值。,其他,酵母提取液、麦芽提取液、苹果和番茄的果汁等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。,、生长调节物质（植物激素）,植物激素（hormone）是植物新陈代谢中产生的天然化合物，能以,极微小的量,影响到植物的细胞,分化、分裂、发育,，影响到植物的,形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老,和,休眠,以及,萌发,等多种生理生化活动，是培养基的,关键物质,。,主要包括：,生长素、细胞分裂素、赤霉素,生长素L,细胞分裂素0.0510mgL。,（）生长素类,(auxin),生长素主要被用于,诱导愈伤,组织形成，促进细胞,脱分化,，,诱导根,的分化和,促进,细胞,伸长,生长。,天然,的生长素,热稳定性差,，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用,人工合成,的生长素类物质,常用,IAA,、,IBA,、,NAA,、,2,4-D,配成,1mg/ml,的溶液贮于冰箱中,IAA-天然生长素，亦可人工合成，其,活力较低,，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，受光也易分解,NAA-启动能力比IAA高出3-4倍，可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，应用较,普遍,IBA-促进,发根,能力较强,NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。,2，4D -启动能力比IAA高10倍，特别是,促进愈伤,组织的形成，同时强烈,抑制芽,的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有,毒效应,腺嘌吟的衍生物，包括,6-BA,、,Kt,、,Zt,等。其中,Zt,活性最强，但非常昂贵，常用的是,6-BA,。,作用：,诱导,芽,的分化,促进,侧芽,萌发生长,促进细胞,分裂与扩大（茎增粗）,，抑制根的分化，延缓衰老,多用于诱导不定芽的分化、芽的增殖。,（）细胞分裂素类(cytokinin，CTK),（）,赤霉素,（gibberellic acid）,有,20,多种，培养基中添加的是,GA,3,，,一般极少使用,作用,促进幼苗,茎的伸长,生长,促进,胚发育,成小植株；,离体培养下，还与,生长素,协调作用对,形成层分化,有影响,当,生长素,赤霉素比值,高,，,木质部分化,，比值低，韧皮部分化。,打破休眠,，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。,在器官形成后，添加赤霉素,有时,可促进器官或胚状体的生长,激素配比模式,生长素/细胞分裂素的比值决定分化发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。,生长素/细胞分裂素,高 利于根、愈伤组织的形成,适中 利于根芽的分化,低 有利于芽的形成,生长素与细胞分裂素同时使用有,协调,作用。同时其在培养基中的,绝对值,也会影响外植体分化发育的方向。,Growth medium is optimised for regeneration of plantlets,No sucrose (0%,),Sucrose reduced to 1%,Sucrose increased to 5%,The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface,Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.,Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured,Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium,tissue culture in the African Violet,No 6-BA,6-BA reduced to 0.1 mg. l,-1,No NAA,Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation,Poor shoot development and no roots,NAA reduced to 0.1 mg. l,-1,More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant,NAA increased to 5.0 mg. l,-1,Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus,No MS salts,No sign of regeneration from explant at all.,MS salts reduced to 0.47 g. l,-1,Some root growth but reduced development of shoots,MS salts increased to 9.52 g. l,-1,Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus,.,其它附加成分,（）,琼脂(agar),是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。,组织培养中最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支持物，常用量,6-10gL,，不是培养基必需成分。,（）活性炭,(active carbon),常用的吸附剂，某些培养类型中，可以吸附培养过程中产生的一些有毒物质，有利于培养物的生长。常用浓度,0.5%,左右，其吸附作用选择性较差，常受温度影响，低温吸附效果好，高温吸附能力降低甚至解吸附。,二、常用培养基的种类、配方及特点,、培养基种类,根据作用分：,诱导,培养基：诱导外植体启动生长。,增殖,培养基：诱导离体培养苗扩大繁殖。,生根,培养基：诱导离体培养苗生根。,根据营养水平分：,基本,培养基：包含无机盐等基本营养成分。,完全,培养基：包含使植物离体生长全面营养。,培养基的种类,1681,，出现由无机盐组成的,Sacks,和,Knop,溶液,，至今仍在作为基本的无机盐培养基,40,年代多用,White,培养基,60,年代至今大多采用,MS,等高浓度培养基,（,可以保证培养材料对营养的需要，由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡,）,培养基的名称，多以发明人的名字来命名，也有对某些成分进行改良称作,改良,培养基。,MS培养基,无机盐和离子浓度较高，硝酸盐含量较其他培养基为高。,B,5,培养基,含有较低的铵，双子叶植物特别是木本植物许多都适于用B,5,。,White培养基,1963年又作了改良，称作White改良培养基。无机机盐数量较低，适于生根培养。,N,6,培养基,成分较简单，KNO,3,和（NH,4,）,2,SO,4,含量高。广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。,KM8P培养基,有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。,三、培养基的配制,、母液的配制和保存,母液是欲配制液的,浓缩液,保证各物质,成分的准确性,，,减少微量元素用药称量误差,配制时能,快速移取，,减少称药麻烦,便于低温保藏。,一般母液配成比所需浓度高,10-100,倍。,注意事项,浓度高耐贮存，但准确度低；浓度过低不耐贮,避免不恰当混合引起沉淀,母液保存在5冰箱中，出现沉淀、霉变的不能使用,母液浓缩倍数=（称取药物的量1000ml）/（每升培养基需药物量母液体积）,（）大量元素,可以混在一起配制成,10100,倍,液（常用50倍）,高浓度,的,Ca,2+,和,Mg,2+,会与磷酸盐混合，产生不溶性沉淀，应单独配制/或者单独配制,CaCl,2,也可,（）微量元素,可配成,50-1000,倍（常用100、200倍）,混合母液，,KI,可单独配。,（）铁盐,硫酸亚铁,和,EDTA,钠盐,易沉淀，需单独配制，配成,100200倍,鳌合剂,不易沉淀。,（）有机化合物,维生素、肌醇、氨基酸等一起配成,100或200,倍液，也可分别配制。,（）激素,每种单独配成母液储于冰箱，浓度一般为,1mg/ml,。一般一次只配,50ml,或,100ml,。,激素难溶于水，配制母液时用,95%酒精,或 1N,HCl,，1N,NaOH,溶解后再定容。,生长素类用,NaOH、细胞分裂素用HCl溶解,（6）有机附加物,椰乳,液体胚乳（纱布,滤渣,）,-80,水浴滤液（,20,分钟）,-,过滤,（去蛋白）,-,高温高压灭菌,-,冰箱保存,酵母提取液,酵母粉（加水煮沸,30,分钟）,-,过滤去渣,-,消毒,、培养基的配制及灭菌,培养基配制程序：,取适量蒸馏水放入容器将母液取出混合,将琼脂和糖加入容器,蒸馏水定容至,所需体积,调整,p,分装培养瓶,培养基的灭菌：,湿热灭菌法，灭菌1520min,某些遇热不稳定的物质如IAA、ZT等进行过（抽）滤灭菌,第三节外植体的选择与培养,植物细胞组织培养的成败除与培养基的组分有关外，另一个重要因素就是外植体本身，为了使外植体适于在离体培养条件下生长，使组织培养工作顺利进行，有必要对外植体进行选择与处理。,一、外植体的选择,有,代表性,的主要植物,优良,的种质、,特殊,的基因型,在植株生长的最适时期取材（花药培养在,单核期,取材）,大小一般在,之间（胚胎培养或脱毒在,以下），材料太大易污染，材料太小难于成活。,从,生长健壮,的,无病虫害,的植株上选取,发育正常,的器官和组织。,最好采用茎尖,，后代性状较稳定，携带细菌较少。,二、外植体的灭菌,外植体选取 流水冲洗 （转入超净工作台）,70%,酒精表面消毒,2060s,无菌水冲洗,消毒剂,处理 无菌水充分洗净备用,三、外植体的接种（无菌操作）,外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切,碎或分离出器官、组织、细胞、转放到无菌培养基上,的全部操作过程。,整个过程均需无菌操作。,（1）借助,接种用工具,将材料,切割,分离。,（2）将培养基放入超净工作台内，,火焰灼烧培养基瓶口,，然后打开培养瓶口，置培养瓶为,斜角,，避免灰尘杂菌落入瓶中。,（3）迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。,（4）工具用后应及时灭菌，避免,交叉污染,。,（5）工作人员操作时禁止不必要的谈话。,四、外植体的培养,主要因素：,光照、温度、湿度、氧气,、光照,光照强度、光质以及光照时间，对细胞的增殖、器官的分化都有很大影响。除特殊要求外，一般都采用,日光灯,作光源，光照强度,1000-5000Lx,，根据不同植物或器官需要，可以每天连续光照,12-16小时,，也可每天光照,16,小时，,8,小时黑暗。,、温度,大所数植物最适温度在,23-32,之间。培养室温度是,252,。,、湿度,培养瓶内相对湿度常是,100%,，培养室一般要求相对湿度保持在,70-80%,，相对湿度,过低影响培养物生长和分化，应向室内喷洒水，以提高湿度；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除湿,。,、氧气,接种时要有部分组织和空气接触。,振荡培养,是解决通气的良好办法。固体培养中，如瓶塞不透气，培养物也不能生长，要选择,通气性好的培养瓶盖,，增加可利用的氧气，迅速除去释放出来的,CO2,，有利于外植体外层细胞开始分裂。,、,pH,值,不同的植物对培养基最适,pH,值的要求也是不同的，,大多在,5,左右，一般培养基皆要求，,这基本能适应大多植物培养的需要。,五、外植体的成苗途径,外植体的成苗途径有三种：,（一）外植体-愈伤组织-完整植株,同时长芽和根,-,植株,芽,-,根,-,植株,根,-,芽,-,植株,（二）外植体,-,胚状体,-,植株,器官上,愈伤组织,游离单细胞,小孢子,诱导胚状体比诱导芽,数量多、速度快、结构完整,（三）,外植体,-,直接形成根与芽,-,植株,六、培养中常见问题,（,一）,污染,病原菌 ：,细菌、真菌,细菌,污染：菌斑呈,黏液状,，接种后,1-2,天发现。,污染途径：外植体带菌；培养基及器皿灭菌不彻底操作人员未遵守操作规程,真菌,污染：污染部分长有不同颜色的,霉菌,，接种后,3-10,天,发现。,污染途径：周围环境不清洁；超净工作台过滤装置失效；培养瓶的口径过大,在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象,2、污染的预防措施（6点）,（）防止材料带菌的措施,茎尖作外植体时，进行,预培养,（无糖）或暗培养，以,新抽嫩枝,作外植体。,晴天,取材，,下午,取材，经日晒可杀死部分细菌或真菌,接种时除,去外部韧皮,组织，只接内部的分生组织。,（,2,）外植体的灭菌,多次,灭菌法：次氯酸钠-无菌水-次氯酸钠,多药剂,交替法：肥皂水-酒精-次氯酸钠-无菌水,器皿与金属器械的灭菌,玻璃器皿可采用湿热灭菌或,干热,灭菌,金属器皿一般,火焰,灭菌，,也可干热灭菌,（135-140摄氏度灭菌3-5h；160-170摄氏度灭菌2-4h；,180,-200摄氏度灭菌,1h,）,布质制品的灭菌 湿热灭菌,无菌操作室的灭菌,2%,新洁尔灭或,70%,酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。,严格按照无菌操作程序进行,在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术,（二）,褐变,基因型,外植体的生理状态,幼年的材料、分生组织含醌类物质较少,培养基的成分,无机盐浓度过高,生长调节物质使用不当，,BA,过多,培养条件不适宜，,温度过高或光照过强,材料转移时间,时间过长引起材料褐变,外植体体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的,酚类,物质氧化成棕褐色的,醌类,物质，这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。,1、影响因素,选择,适宜的外植体,及,最佳培养基,提高,转管,率,加,抗氧化剂,（抗坏血酸、,PVP、牛血清白蛋白等）,加,活性炭,0.1-0.5%,活性炭,2、褐变的防止措施,（三）玻璃化,（Vitrification）,组培苗外观形态呈,半透明状的生长异常现象,叶、嫩梢呈水晶透明或半透明,水浸状,；矮小,肿胀失绿,；叶片皱缩卷曲、,脆弱易碎,叶表几,无角质层,蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织,体内,含水量高,，干物质低，,光合能力和酶活性降低,，,组织畸形,，,器官功能不全,，分化能力降低,生根困难,，很难继续培养和移栽成活,激素,：CTK浓度、比例过高（继代次数太多）,琼脂,：琼脂浓度低（培养基太“稀”）,温度,：低温,光照,时间：光照太多、太强,通风,条件：气体交换不良,(6),离子,水平：无机离子种类及比例不当,主要原因,提高蔗糖和琼脂浓度（提高,渗透势,）,适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素比例,适当增加,Ca,、,Mg,、,Mn,、,K,、,P,、,Fe,、,Cu,，降低,N,（,铵态氮,）和,Cl,（,重选或改良培养基配方,）,增加,自然光照，,1000-1800lx,，控制光照时间,8-12h,。,适温,生长，热击处理,使用透气性好的封口膜,培养基中加入,青霉素,、,间苯三酚,、,根皮苷,或,多效唑,等,预防措施,第四节试管苗的驯化与移栽,一、试管苗的特点,1、试管苗的生态环境,高、恒温,试管苗整个生长过程中采用的是,恒温培养，温差很小,。并且温度一般控制在,25,+,2,甚至更高。,外界环境条件,温度不断变化,，其调节由太阳辐射决定，,温差很大（季节、日夜）,，而且一般不会达到,25,+,2,。,组织培养出来的苗通称试管苗或组培苗,高湿,试管瓶内水分移动途径有两条：,试管苗水分从气孔蒸腾,培养基向外蒸发，凝结后又进入培养基,瓶内相对湿度接近100%,，远远大于瓶外空气湿度，故,试管苗蒸腾小,。,弱光,试管瓶内光照一般比太阳光弱，幼苗生长也较弱，不能受太阳光直接照射。,无菌,试管苗所在环境无菌，与外界有菌环境不同，试管苗也无菌，同时，培养瓶内气体环境较为特殊，与外界环境有很大差异。,试管苗,生长细弱,、茎叶表面角质层不发达,叶绿体的,光合作用,较,差,叶片,气孔数目少,，活性差,根,的,吸收功能差,对逆境的,适应性,和抵抗能力较,差,2、试管苗特点,二、试管苗的驯化,1、目的,提高,试管苗对外界环境条件的,适应性,，提高光合能力，使试管苗,健壮,，提高试管苗,移栽成活率,。,2、原则,逐步调,节,温、湿、光、无菌等环境要素，循序渐进,3、驯化方法（炼苗）,培养室培养 半遮荫的自然光，打开瓶盖（无菌到有菌），注入少量自来水（逐渐降低幼苗温度）,一般进行,1-2,周,三、试管苗的移栽,1、常规移栽法,将已诱导出大量根的试管苗，驯化,3-5,天，移到无菌混合土中，当长出,2-3,片新叶时，栽到田间或盆钵中。,2、直接移栽法（极少使用）,直接将试管苗移栽到盆钵的方法。,3、嫁接移栽法,用试管苗做,接穗,嫁接在同一植物的实生苗上。,嫁接移栽优点：,移栽成活率高。,适用范围广，也适用于弱苗或污染苗,需时间短，,20,天成活，缓苗期,10-15,天,植株生长发育较快,1、壮苗移栽,2、生长素,（NAA）,处理,3、降低无机盐浓度（移栽初期也不要施肥）,4、生根培养基中添加活性炭（生根多）,5、避免太阳直射，温度,25-30,，湿度在,85%,以上（关键在移栽后10天）,6、使试管苗逐渐从无菌向有菌过渡,四、提高试管苗移栽成活率的途径,思考题：,说明外植体离体培养中污染的防治措施。,褐变及玻璃化的原因及防治措施,试管苗驯化原则、目的和方法,植物组织培养的一般过程,作业一：,1、,名词解释：植物组织培养、愈伤组织、外植体、玻璃化、褐化,2 、说明植物离体培养的培养基制备程序。,3、说明外植体无菌接种程序。,4、,说明外植体离体培养中污染的防治措施。,谢谢！,