第十章氨基酸药物完整

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,生物制药工艺学,周口师范学院,第十章 氨基酸药物,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,生物制药工艺学,周口师范学院,第十章 氨基酸药物,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第十章氨基酸药物完整,生产氨基酸的大国为日本和德国。,日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。,日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。,第一节 氨基酸,amino acid,的种类和物化性质,一 结构,二 命名和分类,1,命名,天然产氨基酸多用习惯名称，即按其来源或性质命名。例如门冬氨基酸最初是由天门冬的幼苗中发现的；甘氨酸是因为具有甜味而得名。,2,氨基酸的分类,根据,氨基酸侧链结构,，分为三类：,脂肪族氨基酸,芳香族氨基酸,杂环族氨基酸,脂肪族：,（,15,种）,中性氨基酸,：甘（,Gly,）、丙（,Ala,）、缬（,Val,）、亮（,Leu,）、异亮（,Ile,）,含羟基或硫氨基酸,：丝（,Ser,）、苏（,Thr,）、半胱（,Cys,）、甲硫（,Met,）,酸性氨基酸及其酰胺,：天冬氨酸,(Asp),、谷氨酸,(Glu),、天冬酰胺,(Asn),、谷氨酰胺,(Gln),碱性氨基酸,：赖,(Lys),、精,(Arg),芳香族,：苯丙,(Phe),、酪,(Tyr),、色,(Trp),杂环族,：组,(His),、脯,(Pro),脂肪族氨基酸（,15,种）,（,1,）侧链是烃链,-,中性,后三种,人体不能合成，是,必需氨基酸,Gly,是,唯一不含手性碳原子,的氨基酸,（,2,）侧链含有羟基,许多,蛋白酶的活性中心,含有,Ser,，它还在,蛋白质与糖类及磷酸的结合,中起重要作用。,（,3,）侧链含硫原子,（,4,）酸性氨基酸及其酰胺,不带电荷,，但,极性很强,，经常出现在,蛋白质表面,在蛋白质中带,负电荷,，经常出现在,蛋白质表面,（,5,）碱性氨基酸,胍基,碱性最强的氨基酸,芳香族氨基酸（,3,种）,吲哚基,都有,紫外吸收,，可通过测量蛋白质的紫外吸收来测定蛋白质含量,杂环氨基酸（,2,种）,咪唑环,亚氨基酸,His,组氨酸,是,碱性,氨基酸，碱性较弱，是否带电与环境有关。,氨基酸可按,侧链极性,分类：,非极性氨基酸,：,Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro,共八种,极性不带电荷,：,Gly, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Cys,共七种,带正电荷,：,Arg, Lys, His,带负电荷,：,Asp, Glu,从,营养学角度,分类：,必需氨基酸（,Essential amino acids,）,(8,种,),：,人不能合成。,Met,Trp Val Lys Ile Leu Phe Thr,甲硫 、色 、缬,、赖 、异亮 、亮 、苯丙 、苏,假 设 借 来 一 两 本 书,半必需氨基酸：人体合成精氨酸、组氨酸的能力不足于满足自身的需要，需要从食物中摄取一部分,非必需氨基酸（,Nonessential amino acids,）,(10,种,):,人自己可以合成，不需要有食物供给。,21,硒半胱氨酸是一种氨基酸，存在于少数一些酶中，如谷胱甘肽过氧化酶、甲状腺素,5-,脱碘酶、硫氧蛋白还原酶、甲酸脱氢酶、甘氨酸还原酶和一些氢化酶等。化学式：,C3H7NO2Se,22,吡咯赖氨酸在产甲烷菌的,甲胺甲基转移酶,中发现，是目前已知的第,22,种参与蛋白质生物合成的氨基酸,3,、性质,物理通性：天然氨基酸纯品均为白色结晶性粉末，熔点及分解点均在,200,以上。在水中溶解度各不相同，在有机溶剂中溶解度一般较小。均为两性电解质，各有一定等电点。除甘氨酸外都有旋光性。,化学通性：解离、酰化、烷基化、脂化、酰氯化、酰胺化、脱羧、脱胺等反应。,4,、医药应用,（一）氨基酸的营养价值及其与疾病治疗的关系；必须氨基酸、半必须氨基酸（精氨酸和,组氨酸,）、非必须氨基酸。,功能：对婴儿而言，氨基酸能够促进钙的吸收、加速骨骼的生长，有助婴儿的生长发育；,（二）治疗消化道疾病的氨基酸及其衍生物,这类氨基酸主要为谷氨酸及甘氨酸及其衍生物；,（,三）治疗肝性脑病的氨基酸及其衍生物,组织中的氨基酸经过联合脱氨作用脱氨或经其它方式脱氨，这是组织中氨的主要来源。膳食中蛋白质过多时，这一部分氨的生成量也增多。 直接来源。,氨中毒,注射谷氨酸盐,喝水,氨中毒,（四）治疗脑及神经系统疾病的氨基酸及其衍生物；,.,缬氨酸（,VAL,）,1,、促使神经系统功能正常,2,、如果缺乏时，会造成触觉敏感度特别提高，肌肉的共济运动失调,3,、可作为肝昏迷的治疗药物,精氨酸强化精氨酸的胃肠营养支持中,发现精氨酸可增加机体内氮的潴留,调节控制蛋白质的更新,促进肌肉内蛋白质的合成,有助于改善机体氮平衡,提高机体的免疫状态。在多种动物模型中观察到,给予精氨酸后可产生以提高,T,淋巴细胞间接反应为中介的免疫防御和免疫调节作用 。,（五）用于肿瘤治疗的氨基酸及其衍生物：,（六）其他氨基酸类药物的临床应用,.,丝氨酸 （,SER,）,1,、降低血液中的胆固醇浓度，防治高血压,2,、是脑等组织中的丝氨酸磷脂的组成部分,3,、结核细菌病有效果，可治疗肺病 色氨酸（,TRY,）,1,、促进血红蛋白的合成,2,、促进生长，增加食欲,3,、甜味为砂糖的,35,倍，配制生产的低塘食物等对糖尿病、肥胖病人食用较好,氨基酸类药物的常用生产方法,蛋白水解提取法,直接发酵法,微生物发酵法,微生物转化法,化学合成法,酶合成法,第二节 氨基酸类药物的生产方法,一,.,水解法,定义：以毛发、血粉、废蚕丝等蛋白质通过酶法，酸、碱等处理得到各种氨基酸的方法。,蛋白质水解方法：,（,1,）酸水解法：,（,2,）碱水解法：,（,3,）酶水解法,特点：,原料来源丰富，投产比较容易。,由于生产出来的是多种氨基酸的混合物，需要后期分离纯化。,产量低，成本高。,二,.,化学合成法：,即利用有机合成和化学工程结合的技术生产氨基酸的方法。,优点：氨基酸的品种不受限制，除制备天然氨基酸外，还可以制备各种特殊结构的非天然氨基酸。,缺点：合成得到的氨基酸都是,DL,型外消旋体，必须经过拆分，才能得到人体能够利用的,L,型氨基酸,。,三、发酵法,发酵法是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对菌株进行诱变等处理，选育出种各营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性变异菌，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏，达到过量合成某种氨基酸的目的。,三、微生物发酵法,直接发酵法：,以糖为碳源、以氨或尿素为氮源，通过微生物的发酵繁殖，直接生产氨基酸的方法。,微生物转化法：,利用菌体的酶系，加入前体物质合成特定氨基酸的方法。,基本过程：菌种的培养、接种发酵、产品提取、分离纯化,菌种：细菌、酵母、基因工程菌（苏氨酸、色氨酸）。,产品：谷氨酸、谷氨酰胺、丝、酪氨酸。,优点：直接生产,L-,型氨基酸，原料丰富，成本低。,缺点：产物浓度低，生产周期长，设备投资大，有副产物，单晶体氨基酸的分离比较复杂。,第三节 赖氨酸的生产,缺乏赖氨酸的症状包括疲劳，虚弱，恶心，呕吐，头晕，没有食欲，发育迟缓，贫血等。可以在医疗专业人员建议下采取赖氨酸营养补品。赖氨酸每日的建议摄入量是儿童每磅体重,10,毫克，成年人每天在,3000-9000,毫克之间。,在动物蛋白质中含量较多。植物蛋白质中一般较少，难于满足人体生长发育的需要,因此,L-,赖氨酸成为目前食品（饲料）中最重要的添加剂，而且谷物中,L-,赖氨酸的含量已成为评价谷类作用的重要标准。,2006,年，进口赖氨酸的平均价格为,13.30,元每,kg,；,2007,年，国内进口赖氨酸的均价约,14.30,，同比上涨了约,6.7%,；国产赖氨酸均价,14.40,元，同比上涨约,10%,。,二 性质,L-,赖氨酸，无色晶体，熔点,224.5,（分解）。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚。目前大规模制备赖氨酸是采用发酵法。,游离的,L-,赖氨酸极易潮解，因具有游离氨基而易发黄变质，并有刺激腥味，难于长期保存。,L-,赖氨酸盐酸盐则比较稳定，不易潮解，便于保存。,三、合成,赖基酸依微生物的种类而异。细菌的赖氨酸生物合成途径需要经过二氨基庚二酸,(DAP),合成赖氨酸,根据赖氨酸的生物合成途径由葡萄糖生成赖氨酸的化学反应式为：,赖氨酸对糖的理论转化率为：,赖氨酸产品一般以赖氨酸盐酸盐形式存在。因此，赖氨酸盐酸盐对糖的理论转化率为：,四 赖氨酸的发酵生产,赖氨酸发酵生产有两种类型，直接发酵法和两步发酵法。,直接发酵法工艺：,黄色短杆菌，谷氨酸棒状杆菌,两步发酵法：大肠杆菌氨基酸营养缺陷型菌株,（一）,L-,赖氨酸生产菌种及扩大培养,1,生产菌种,2,、种子培养：,二级或三级,斜面种子培养这组成：牛肉膏,1,，蛋白陈,1,，,NaCl0,5,，葡萄糖,0,5,，琼脂,2,，,PH,7,0-7,2,。在,30,保温,24h,。,一级种子培养基组成：葡萄糖,2,0,、 硫酸铵,0,4,磷酸氢二钾，玉米浆,1,一,2,，豆饼水解液,1,-2,，,MgS040,04,一,o,o 5,，尿素,0,1,，,pH,7,0,一,7,2,，接种量约为,5,一,10,。,培养条件,：,30,一,32,振荡培养,15,16h,，转速,100,一,120r,min,。,二级培养：见书中,（二）赖氨酸发酵工艺及控制要点,赖氨酸发酵过程分为两个阶段，发酵前期,(,约,0-12h),为菌体生长期和产酸期。,(1),温度,赖氨酸发酵，前期控制温度,32,，后期,30,。,(2)pH,值控制,发酵最适,PH,值为,6,5-7,0,。控制范围在,pH,6,5-7,5,整个发酵过程保持,pH,值平稳。,(3),种龄和接种量,(4),供氧,供氧不足，细菌呼吸受抑制，赖氨酸产量降低,.,(5),生物素,(6),硫酸铵,硫酸铵在无其他铵离子情况下，硫酸铵用量为,4,o,一,4,5,时，赖氨酸产量最高。,五 赖氨酸的酶法生产,酶法转化,1,酶法转化的方法,将含有,D,氨基己内酰胺消旋酶的无色杆菌与含,L-,氨基己内酰胺水解酶的隐球酵母混合培养，使,DL,氨基己内酰胺,DL-Amino-omega-caprolactam,直接转化，全部生成,L,赖氦酸。,利用,D-,氨基己内酰胺消旋酶，将,D-,氨基己内酰胺消旋化，生成,L,氨基己内酰胺，再利用,L,氨基己内酰胺水解酶将,L-,氨基己内酰胺水解，生成,L-,赖氨酸。,2,酶法反应工艺,反应实例：,10,、,100mL(780m mol),的,DL,氨基己内酰胺,(,用,HCl,调,pH,8,0),，加入,0,1g,隐球酵母的丙酮干燥菌体及,0,1g,无色杆菌的冷冻干燥菌体，置于,300mL,的三角瓶中，在往复式摇瓶机上进行振荡培养，温度保持,40,，反应时间为,24h,。上情液中测不出,D-,氨基己内酰胺。加人少量活性炭，搅拌并煮沸,3min,，冷却至室温，过滤后用盐酸调,pH,4,1,，真空浓缩，,60,干燥，得到,L,赖氨酸盐酸盐，纯度为,99,5,。,酶法拆分,酶水解后生成的,L-,赖氨酸不溶于有机溶剂，而,N-,乙酰,-D-,赖氨酸则能溶解。故加入有机溶剂，,L,赖氨酸即析出。常用的有机溶剂为乙醇、醋酸乙酯或磷酸三丁酯。母液中的乙酰,D,赖氨酸经真空浓缩至干，在用,6molHCl,水解即得,D-,赖氨酸盐酸盐。,六提取和精制,1,发酵液,由以下四部分组成,(I),氨基酸,(2),菌体,(3),培养基残留物,(4),色素,2,提取,从发酵液中提取赖氨酸通常有四种方法：沉淀法，利用赖氨酸生成难溶性盐沉淀分离，或使赖氨酸结晶析出，有机溶剂抽提法；离子交换树脂吸附法；电渗析法。,强酸型树脂和弱酸型树脂,3,离子交换法提取赖氨酸,1,）上柱吸附,2,）洗脱,氨水、氨水,+,氯化铵、氢氧化钠,用茚三酮检验流出液，当有赖氨酸流出时可以收集。,4,浓缩,1,）浓缩与除氨,经过离子交换提取的赖氨酸洗脱液，体积较大，赖氨酸含量较低，约为,60-80g,L,，还含有较多的氨约为,10-15g/L,，因此需要进行浓缩和除氨。,温度,70,以下，真空度,0,08MPa,左右,2,）赖氨酸盐酸盆的结晶与分离,赖氨酸盐酸盐浓缩液放入搅拌罐中，搅拌结晶,16,20h,，为使晶体不太细，结晶过程应控制温度，最好在,5,左右结晶完毕停止搅拌，用离心机分离，用少量水洗晶体表面附着的母液。母液经浓缩，结晶，再结晶，直至不能析出结晶时，将母液稀释，上离子交换柱吸附回收赖氦酸。所得的品体为粗晶体。,3,）赖氨酸盐酸盐的重结晶与干燥,结晶析出的赖氨酸盐酸盐晶体含量约为,78,一,84,，除含有一定水分,(15,一,20,),外还含有色素等杂质。,赖氨酸盐酸盐粗结晶加一定量的水，加热,70,一,80,使其溶解,16Be,加人,3,一,5,活性炭搅拌脱色，过滤得赖氨酸盐酸盐清液。真空蒸发浓缩，放入结晶罐中搅拌结晶，,16,20h,后经离心分离除去母液，晶体用少量水洗去表面附着的母液。赖氨酸盐酸盐晶体在,60,一,80,下进行干燥，至含水,0,1,以下，然后粉碎至,60,一,80,目，包装即得成品。,总结,1,氨基酸的分类与命名,2,氨基酸的性质,3,氨基酸的应用,4,氨基酸的生产方法和发酵生产,思考题,1,氨基酸类药物的生产方法,谢谢,