第一节概述第二节血脂脂蛋白及载脂蛋白测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第一节概述第二节血脂脂蛋白及载脂蛋白测定,一、血脂和血浆脂蛋白 自学,二、脂蛋白代谢紊乱,（一）高脂蛋白血症,血脂含量超过正常称为高脂血症，由于血脂均以血浆脂蛋白的形式存在，故也称为高脂蛋白血症。按发病原因分为两大类。,1.,按表型分类,以,Fredrickson,（,1967,）分类法为基础，经,WHO,（,1970,）修订的分类系统，根据血清,TC,、,TG,、外观和脂蛋白电泳图谱，将其分为,6,型。,第一节 概 述,（,1,）,型高脂蛋白血症,又称高乳糜微粒血症。,是一种常染色体隐性遗传病。由于,LPL,缺损或,LPL,活化因子（,ApoC,）缺损所致。婴儿期即可发生，但罕见。其生化检查特征：,4,冷置试验，血清上层为奶油状，下层清亮。,血清,TG,，达,11mmol/L,以上，血清,TC,正常或轻度。,血清,LPL,活性。,血清脂蛋白电泳，,CM,。,（,2,）,a,高脂蛋白血症,又称高,-,脂蛋白血症或高胆固醇血症。,属常染色体显性遗传，有明显的家族史。病因,LPL,受体缺损，杂合子型发生频率为,1/500,，纯合子型发生频率为,1/100000,。其生化检查特征：,4,冷置试验，血清外观清亮透明。,血清,TC,，尤其是,LDL-C,，,TG,正常。,血清脂蛋白电泳，,-LP,。,临床表现，中青年常伴有冠状动脉硬化，结局为心肌梗塞。,（,3,）,b,型高脂蛋白血症,在,a,型基础上伴有,VLDL,（高,LDL+VLDL,血症），病因不明。其生化检查特征：,4,冷置试验，血清外观清亮或微混。,血清,TC,，,TG,。,血清脂蛋白电泳，,-LP,，,pre-LP,。,（,4,）,型高脂蛋白血症,又称宽,-,脂蛋白血症。,属常染色体显性遗传病，发病率,1/10000,，病因，,ApoE,异常，与相应受体结合率。其生化检查特征：,4,冷置试验，血清外观混浊，后形成蜡样黄色薄膜。,血清,TC,，,TG,。,血清脂蛋白电泳，,-LP,，,pre-LP,，,IDL,。融合形成宽,区带。,（,5,）,型高脂蛋白血症,又称高前,-,脂蛋白血症或家族性高甘油三脂血症,。属常染色体显性遗传病，较常见，我国原发性高脂蛋白血症中一半属于此型。病因，,ApoA,2,异常。其生化检查特征：,4,冷置试验，血清外观混浊。,血清,TG,，,TC,正常或稍。,血清脂蛋白电泳，,pre-LP,。,临床表现，多见于中年人易发生冠心病。,（,6,）,型高脂蛋白血症,属常染色体显性遗传病，病因不详，可能由几种遗传缺陷所致，较罕见。生化检查特征：,4,冷置试验，血清上层为奶油状，下层混浊。,血清,TG,，,TC,。,血清脂蛋白电泳，,CM,，,pre-LP,。,2.,按是否继发于全身性疾病分类,分为原发性和继发性高脂血症。常继发于糖尿病、肝病、肾病、肥胖以及过量饮酒，成人发病率为,3%,5%,。,3.,高脂血症的基因分型法,一部分高脂血症患者存在单一或多个遗传基因的缺陷，具有明显的家族聚集性，有明显的遗传倾向。,（二）低脂蛋白血症,主要有四种类型,1.,低,LDL,血症,是一种常染色体显性遗传病，病因,ApoB,100,低下，血浆,LDL,减少，,TC,。,2.,无,LDL,血症,罕见的常染色体隐性遗传病，病因,ApoB,100,、,B,48,缺损，血浆中无,LDL,，,TC,。,3.,低,HDL,血症,病因不详，血清,TG,，动脉粥样硬化、冠心病的发病率高。,4.,无,HDL,血症（,Tangier,病）,罕见的常染色体隐性遗传病，,ApoA,、,A,缺损，血浆,TC,，,HDL-C,。,血脂测定方法很多，目前临床实验室,基本检验项目,有：,血清外观分析，,TC,，,TG,，,HDL-C,，,LDL-C,测定。,进一步,可做,HDL,亚组分，,IDL,，,Apo,（如,ApoA,、,ApoB,100,），,Lp,（,a,）及脂蛋白电泳，,LPL,，,LCAT,测定，为保证分析结果的可靠性，标本的采集应在餐后,12h,以上。,第二节血脂、脂蛋白及载脂蛋白测定,一、血清外观分析（血清冷置试验）,混浊,（,TG,增高）,下层浊（,VLDL,增高）,型,下层清（,VLDL,正常）,型,均匀混浊,（,VLDL,）,TC,正常,型,上层奶油样,（,CM,）,TC,增高,a,型,TC,正常 正常人,清亮,（,TG,正常）,TC b,，,型,空腹,血清,测,TC,4,过夜,测,TC,二、血清总胆固醇测定,胆固醇是人体重要的脂类成分，具有重要的生理功能，如合成类固醇激素，维生素,D3,胆汁酸，并构成细胞膜成分，,TC,包括,FC,（,1/3,）和,CE,（,2/3,），胆固醇与动脉粥样硬化有密切关系，故胆固醇测定是最常用的实验室检测项目之一。,TC,测定方法很多，约,200,多种，分为化学测定法、酶法、气相色谱法、高效液相色谱法、核素稀释质谱法（决定性方法）。,（一）化学测定法 主要有两类,反应,简称,L-B,反应，胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成胆烷二烯阳离子，然后被醋酐，浓硫酸氧化生成绿色的胆烷六烯磺酸。呈色稳定性差。,反应,胆固醇经冰醋酸，浓硫酸脱水生成胆烷二烯阳离子，然后在,Fe,3+,存在下氧化生成紫红色胆烷四烯阳离子，灵敏度较,L-B,反应高,7,倍，且呈色稳定性好，但试剂腐蚀性极大，不能用于自动化分析。,（二）酶法,胆固醇酯 胆固醇 脂肪酸,胆固醇 ,O,2,胆烷,-4-,烯,-3,酮 ,H,2,O,2,H,2,O,2,4AAP,酚 红色亚胺醌 ,H,2,O,CEH,ChOD,POD,试剂中除上述三种酶外，还有胆酸钠和表面活性剂及稳定剂，胆酸钠用于激活,CEH,，表面活性剂促进胆固醇从脂蛋白中释放。,酶法操作简便，快速，试剂无腐蚀性，适合于自动化分析，但也存在有一些不足，,CEH,对胆固醇水解不完全，表面活性剂影响,CEH,活性，黄疸血清中过高的胆红素可还原,H,2,O,2,使结果偏低。,【,参考范围,】,【,临床意义,】,血清,TC,含量受年龄、性别、饮食和运动等因素的影响。,20,岁以上随年龄而，,70,岁以后则有下降趋势。,20,40,岁阶段男性高于女性，但女性绝经后则高于男性。城市人群高于农村人群，与饮食和运动有关。脑力劳动者高于体力劳动者。,病理性高胆固醇血症,原发性高胆固醇血症，糖尿病、胆道阻塞、肾病综合症、甲状腺功能减退。,病理性低胆固醇血症,严重贫血、甲亢、营养不良。,三、血清甘油三脂测定,TG,是有一分子甘油与三分子脂肪酸组成的化合物，主要存在于,VLDL,和,CM,中，临床化学中往往以测定甘油代表,TG,的含量。,TG,的测定方法很多，如气相色谱法、高效液相色谱法、红外分光光度法。但上述方法需特殊的仪器设备和技术，故一般只用于研究工作中。临床实验室主要用化学法和酶法。,（一）化学法,基本步骤可归纳为四步,1.,提取：,甘油三脂的提取 采用合适的溶剂，使脂蛋白变性提取,TG,，同时去除干扰物质,(,磷脂、游离甘油、葡萄糖等,),常用方法有：,（,1,）异丙醇抽提，沸石合剂（沸石、高岭土）吸附。,（,2,）异丙醇抽提，氧化铝吸附磷脂。,（,3,）正壬烷、异丙醇、稀硫酸分溶抽提，免去吸附磷脂的操作，后用价廉的正庚烷代替正壬烷。应用较广。,2.,皂化：,甘油三脂的水解 一般都采用,KOH,乙醇或,KOH,异丙醇溶液，,60,，,5,15min,可使,TG,完全水解。,3.,氧化：,甘油的氧化 最常用的氧化剂是,HIO,4,，甘油在酸性条件下被氧化成甲醛、甲酸。反应受,-,磷酸甘油、葡萄糖、丝氨酸的干扰，故抽提时应尽量除去此类物质的干扰。,4,.,显色：,显色测定甲醛。常用方法有：,（,1,）甲醛与,变色酸,（二羟萘二磺酸）在硫酸溶液中加热生成紫红色化合物。（,570nm,）,（,2,）甲醛与,乙酰丙酮,在氨的存在下缩合成黄色的二乙酰二氢二甲基吡啶。（,420nm,）,（二）酶法,常用的有,：,1.,磷酸甘油氧化酶法（,GK-GPOD-POD,法）,TG,H,2,O,甘油 ,FA,甘油 ,ATP 3-,磷酸甘油 ,ADP,3-,磷酸甘油 ,O,2,磷酸二羟丙酮 ,H,2,O,2,H,2,O,2,4-AAP, 酚 红色亚胺醌 ,H,2,O,试剂较稳定，灵敏度高，线性范围宽，胆红素、维生素,C,可消耗,H,2,O,2,使结果偏低。,LPL,GK,GPOD,POD,2.,乳酸脱氢酶法（,GK-PK-LDH,法）,TG,H,2,O,甘油 ,FA,甘油 ,ATP 3-,磷酸甘油 ,ADP,ADP, 磷酸烯醇式丙酮酸,ATP, 丙酮酸,丙酮酸 ,NADH,H,+,乳酸 ,NAD,+,3.,甘油氧化酶法,第一步消除血清中原有的甘油：,LPL,GPOD,PK,LDH,游离甘油 ,O,2,甘油醛 ,H,2,O,2,GlyOD,H,2,O,2,EMAE,无色物质,EMAE,称,N-,乙基,-N-,（,3-,甲基）,-N-,乙酰乙二胺。是一种还原剂，灵敏度比酚高。第二步测定甘油三脂水解释放的甘油：,TG,H,2,O,甘油 ,FA,甘油 ,O,2,甘油醛 ,H,2,O,2,H,2,O,2,4-AAP,EMAE,有色化合物,POD,GlyOD,LPL,POD,【,参考范围,】,【,临床意义,】,血清,TG,一般随年龄增长而升高，体重超标者往往偏高。,1.,病理性增高,原发性高脂蛋白血症、肥胖症、糖尿病、肾病综合症、脂肪肝、妊娠后期。,2.,病理性降低,甲亢、肾上腺皮质功能减退、严重肝功能损伤。,四、血清（浆）脂蛋白测定,（一）血清脂蛋白电泳,临床实验室常用的支持介质有醋酸纤维薄膜和琼脂糖凝胶。,1.,血清脂蛋白醋酸纤维薄膜电泳,以醋酸纤维薄膜为支持介质，血清脂蛋白经电泳分离，然后用臭氧氧化，使脂蛋白中的不饱和脂肪酸的双键断裂生成醛，再用亚硫酸品红染色，即生成紫红色区带。,2.,血清脂蛋白预染琼脂糖电泳,血清脂蛋白经饱和苏丹黑,B,预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，进行电泳分离，即可得到清晰的兰色区带。,凝胶浓度一般为,0.5%,，超过,1%,，,-Lp,与,pre-Lp,不易分开，,0.5%,，凝胶机械强度太低。,血清：染料为,9,：,1,，染料过多稀释标本，而且染料中乙醇会引起蛋白质变性，影响分离效果。,结果判断，直观区带的着色深浅，宽窄，用浅染，稍浅染，深染及消失加以描述；或用光密度扫描仪测定。,【,参考范围,】,-Lp 30%,40%,pre,-Lp 13%,25%,-Lp 50%,60%,CM,（）,（二）血清高密度脂蛋白测定,常以测定,HDL-C,含量代表,HDL,水平。测定步骤包括,HDL,的分离,；,测定,HDL,中胆固醇,。,HDL,的分离方法有：,超速离心法、凝胶过滤法、免疫化学法、电泳法、沉淀法,。临床,实验室常用沉淀法,。沉淀剂一般为二价阴离子和多价阴离子。如：肝素,-Mg,2+,、硫酸葡聚糖,- Mg,2+,、磷钨酸,- Mg,2+,、聚乙二醇（,PEG,）等。,如：磷钨酸,- Mg,2+,选择性地沉淀血清中的,LDL,和,VLDL,，经离心上清液中保留,HDL,，然后用酶法测定上清液中的胆固醇含量，即代表,HDL,中的胆固醇。,【,参考范围,】,男,女,【,临床意义,】,HDL-C,与冠心病发病呈负相关，,HDL-C,低于是冠心病危险因素。,（三）血清高密度脂蛋白亚组分测定,HDL,有三个亚类（,HDL,1,、,HDL,2,、,HDL,3,）最近的研究工作表明，,HDL,2,亚类与冠心病危险度的相关程度比总,HDL-C,更密切,。,HDL,2,HDL,3,HDL,2,脂类,60%,蛋白质,40%,；,HDL,3,脂类,45%,蛋白质,55%,高密度脂蛋白亚组分的分析方法有超速离心法、柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、多价阴离子分级沉淀法。,其中,多价阴离子分级沉淀法具有快速、经济、简便更为实用，是目前临床实验室最常用的方法,。常用的沉淀剂有硫酸葡聚糖,- Mg,2+,、聚乙二醇（,PEG,）。,【,原理,】,用,PEG,做沉淀剂，以不同浓度的,PEG,在不同,pH,条件下分别将,VLDL,和,LDL,（沉淀剂, 95g/L PEG,，）,HDL,2,（沉淀剂, 170g/L PEG,，）沉淀，上清液中只含有,HDL,（沉淀剂,）和,HDL,3,（沉淀剂,），然后用酶法测定,HDL-C,和,HDL,3,-C,，并以,HDL-C,减去,HDL,3,-C,的差即为,HDL,2,-C,的含量。,【,参考范围,】,HDL,2,-C,男,女,HDL,3,-C,男,女,（四）低密度脂蛋白测定,低密度脂蛋白水平通常以,LDL-C,含量表示。,LDL-C,测定方法很多，常用的有：,1. Friedewald,公式法,LDL-C,TC,HDL-C,式中的浓度单位是,mmol/L,，在一般情况下能得到可被临床接受的近似结果，但,TG,时不能应用此公式计算，否则结果偏差太大。,TG,2.2,2.,聚乙烯硫酸盐沉淀法,聚乙烯硫酸（,PVS,）能选择性沉淀血清中,LDL,，再以血清,TC,减去上清液（含,HDL,和,VLDL,）胆固醇，即得,LDL-C,值。试剂中加入,EDTA,去除两价阳离子，避免,VLDL,共沉，辅以聚乙二醇独甲醚（,PEGME,）可加速沉淀。,3.,直接测定法,匀相的,LDL-C,直接测定法是以不同的表面活性剂的双试剂使非,LDL-C,与,LDL-C,分两步水解，因先消除非,LDL-C,，故也称为消除法。,【,参考范围,】,【,临床意义,】,LDL-C,增高是动脉粥样硬化发生发展的主要危险因素。,（五）脂蛋白（,a,）测定,脂蛋白,(a),是由载脂蛋白,(a),与载脂蛋白,B,100,通过二硫键连接所形成的特殊蛋白。脂蛋白,(a),测定的方法目前常用的是,ELISA,法。,血清中的脂蛋白,(a),与单克隆抗,Lp(a),抗体结合，再与过氧化物酶结合，形成,Lp(a)-,单克隆抗体,-,酶复合物，然后与底物孵育显色。,【,参考范围,】,120,180mg/L,【,临床意义,】,Lp,（,a,）动脉粥样硬化、冠心病的独立危险因素，与动脉粥样硬化成正相关，,血清,Lp,（,a,）浓度,300mg/L,时，其冠心病的发病率高于健康人的,2,5,倍。血清,Lp,（,a,）水平主要决定于遗传，个体间,Lp,（,a,）水平差异很大，但同一个体血浆,Lp,（,a,）水平的变化较小，环境、饮食、药物对它的影响不明显。,五、血清载脂蛋白,A,及,B,测定,脂蛋白中的蛋白质部分称为载脂蛋白（,apolipoprotein,，,Apo,），可分为,A,、,B,、,C,、,D,、,E,、,F,、,G,、,H,八类，其中,ApoA,，,B,，,C,还有亚类。,ApoA,是,HDL,的主要蛋白质,，占,HDL,蛋白质的,85%,左右，它的血清浓度可代表,HDL,水平，,ApoB,是,LDL,的主要蛋白质,，占,LDL,蛋白质的,97%,左右，,ApoB,浓度主要反映,LDL,水平。,Apo,的测定方法主要有三类：,层析分离,，然后再按一般蛋白质定量；,电泳分离,后经染色光密度扫描定量；,各种免疫分析法,。,层析法操作麻烦，一般只用于研究；电泳法简便灵敏，但各类,Apo,染色性能不一致，重复性不好；免疫法特异性好，灵敏度高，不需预先分离脂蛋白，适合临床实验室的应用，但需特异抗血清。,目前常用的免疫学方法有：,1.,单向免疫扩散法（,RID,）,方法简单，但需时间长，灵敏度较低。,2.,火箭免疫电泳法（,IE,）,比,RID,快速、灵敏，抗血清用量少。,3.,免疫比浊法,测定抗原抗体复合物形成而产生的混浊，方法简便、快速，适合于自动分析仪，灵敏度高于火箭电泳法，免疫比浊法又分为：散射比浊法和透射比浊法。,4.,酶联免疫吸附法（,ELISA,）,需制备指示酶与,Apo,或其抗体的交联物（现有商品化试剂盒）和酶标仪。,5.,放射免疫法（,RIA,）,用核素标记抗原作为示踪物，灵敏度可达,3,5g,。,6.,荧光免疫分析法（,FIA,）,7.,化学发光免疫法（,CLIA,）,【,参考范围,】,Apo A,【,临床意义,】,Apo A,是,HDL,的主要结构蛋白，,Apo B,是,LDL,的主要结构蛋白，因此，,Apo A,和,Apo B,可直接反映,HDL,和,LDL,的含量。但在某些病理情况下，,Apo A,与,HDL,和,Apo B,与,LDL,并非成正相关，临床上常将,Apo A,和,Apo B,比值作为冠心病的危险指标。,谢谢观赏,