放射自显影教学

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,放射自显影教学,定义：,放射自显影是一种利用放射性核素发射的射线，使乳胶中的卤化银感光而形成潜影，经显影和定影，形成图像。借助感光银颗粒所在的部位和强度，通过影像分析，能准确地判断放射性示踪剂的分布部位和数量（半定量），这种技术称为,放射自显影术,（autoradiography）。这种技术得到的图像称为,放射自显影像,（autoradiogram），以上两种术语均可简称为,放射自显影,（ARG）。,第一节 基本原理,一、潜影的形成和消退,二、类型,三、常用的感光材料,四、常用的放射性核素,五、照相处理,六、放射自显影的分辨力,七、放射自显影的本底、效率,一、潜影的形成和消退,（一）潜影形成的原理,放射自显影原理与光学摄影原理基本相似。乳胶中的每颗溴化银晶体都是由Ag,+,和Br,-,的点阵构成。在制作过程中，点阵存在缺陷，这些缺陷即是潜影形成过程中的敏化中心。射线与乳胶相互作用，引起电离作用，使Ag,+,还原为Ag原子，形成潜影。,潜影形成步骤,1、发射电子,：,核射线与溴化银作用，使其电离，射出电子，向敏化中心移动形成阴电层。,AgBr,+,粒子Ag,+,+Br,-,+e,-,2、,Ag,+,的还原：,Ag,+,向敏化中心移动，与e-结合，还原成银原子。,e,-,+Ag,+,Ag,3、潜影形成：,还原的银原子起催化作用，致周围的Ag,+,被还原，形成潜影。,Ag Ag nAg,潜影经显影液和定影液处理即成为自显影图像。,（二）潜影的消退,有潜影形成的结晶在显影液的作用下，溴被洗去，银原子则留下来成一个黑色颗粒。潜影如未及时显影，则在水、氧等作用下还原的银原子会减少，使潜影消退。故曝光应在,干燥、低温、少氧,的环境下进行。,二、放射自显影的类型,（一）宏观自显影,（,macroscopic ARG,）：,又称大体自显影，观察范围较大，分辨力低，只能供肉眼或放大镜观察，或根据黑度判断示踪剂的分布及相对数量。此种自显影适用于小动物的整体标本，大动物的整个脏器或肢体，以及层析板、免疫沉淀板、骨骼、牙齿的磨片或剖面等的研究。,（二）显微镜自显影,（,light microscopic ARG,）：,又称光学显微镜自显影，是借助显微镜进行组织或细胞学观察，分辨能力要求较高。根据银颗粒来判断示踪剂的分布部位和数量的多少。适用于组织切片、细胞涂片等标本的研究。可以对不同细胞进行比较，并根据不同示踪剂在不同时间的分布，研究细胞水平的代谢过程。制备一般采用液体乳胶法。,（三）电子显微镜自显影,（,electron microscopic ARG,)：,用于示踪剂在亚细胞结构中分布情况的研究，能显示出普通显微镜观察不到的细微结构与放射性核素分布的关系。适用于细胞超微结构，甚至大分子（DNA 、RNA）上的精确定位和定量，也可观察动态过程。此类技术要求标本在100nm以下的超薄切片，乳胶厚度仅相当银颗粒的直径（约140nm）。,三、常用的感光材料,放射自显影常用的感光材料包括各种类型的原子核乳胶、X线胶片、电影正片、氚片或幻灯片。,（一）原子核乳胶,简称核乳胶，由溴化银和明胶组成。常温上呈半固体，低温为明胶状，温度升至40左右为液态。使用时乳胶涂层厚度可由乳胶量和稀释度（用去离子水稀释）进行调节。,液体乳胶直接涂在标本或支持物上，多用于光镜和电镜自显影。将液体核乳胶涂在玻片上，可抽成,核乳胶干板,（nuclear emulsion plate），再于标本接触形成自显影像，多用于光镜自显影或宏观自显影。也可将干板将乳胶层从玻片上揭下来，称为,揭膜核乳胶,（stripping film emuslon），多用于定量的光镜自显影。,由溴化银、碘化银和明胶组成，银晶体颗粒平均直径1,m，对低能射线敏感度高，对暗室的安全光也有相当耐受。乳胶涂在醋酸纤维素酯片基的单面，乳胶面没有保护层。使用时要注意保护乳胶层面，该面直接与标本接触，以获得最佳灵敏度。主要用于,3,H标记化合物的宏观自显影或低倍光镜自显影。,（二）氚片,（,tritum film,）,（三）X线片,（,X-ray film,）,m，对射线分辨率较低，对暗室内的安全光有一定的耐受。乳胶涂在醋酸纤维素酯两面，外覆保护层。主要用于核素射线能量较高的宏观自显影或低倍光镜自显影。,四、常用的放射性核素,选择放射性核素应考虑其,射线种类、能量,和,半衰期,。,核素 半衰期 射线类型 射线平均能量（MeV,）,3,H,12.33年, 0.005,14,C 5730年, 0.05,32,P 14.28天, 0.695,35,S 87.4天, 0.055,45,Ca 165天, 0.10,59,Fe 44.6天, 0.12,125,I 60.2天,、,0.0037,五、照相处理,（一）显影和定影,（二）显影液和定影液,（三）干燥、染色和封固,（一）显影和定影,感光材料与标本接触后，经射线的作用溴化银晶体形成潜影，未受核射线作用的溴化银则不形成潜影。这两种晶体经显影和定影，才能将其区分。,显影的作用是使银盐还原,，有潜影的结晶比无潜影者显影快，因此适当控制显影时间可只使受照射的结晶呈现黑色颗粒，,定影的作用是洗去未感光的银盐,。,（二）显影液和定影液,显影和定影是由显影液和定影液来完成的。,常用的显影液为D-19b,，,定影液为F-5,。显影液和定影液的温度应严格控制在191，显影时间2-4min。显影结束后用水充分漂洗，然后进行定影。定影时间4-8min，经水充分冲洗后晾干。显影和定影的具体时间可通过实践选定。,D-19b显影液和F-5定影液配方,D-19b显影液配方 F-5定影液配方,水（5）(ml) 700 水（5）(ml) 800,米吐尔（g） 2 硫代硫酸钠(g) 240,无水亚硫酸钠(g) 72 无水亚硫酸钠(g) 15,对苯二酚（g） 8.8 28%醋酸(ml) 48,溴化钾(g) 4 钾矾(g) 15,加水至(ml) 1000 加水至(ml) 1000,（,三）干燥、染色和封固,经显影、定影和冲洗等处理的乳胶可空气或人工干燥，但干燥过程应避免尘粒沾污乳胶，也可用酒精进行脱水干燥。干燥后可按常规方法染色（如苏木精-伊红），染色后可用盖坡片封固。,六、放射自显影的分辨力,放射自显影的目的在于研究放射性核素或其标记化合物在组织内的位置，所以放射自显影的分辩力，主要是指,位置,的分辩力。故,分辨力就是指两个相邻的放射性核素分子在标本中的距离近以多少能在显影银颗粒上显示为两个颗粒。,银颗粒显影,放射源,可分辨,不可分辨,半距离,（,half distance，HD）,衡量分辨力常用半距离来表示。即一线性放射源，其显影的银颗粒分散在放射源的两侧，银颗粒随着与放射源的距离的增加而减少，当银颗粒减少到一半时，此距离称,半距离,。若放射源为点状源则以,半半径,来表示。,HD,影响分辨力的主要因素：,1、,核素的能量,：核素的能量越高，射线的射程较长。分散的银颗粒就较多，因而分辨力下降。如在相同条件下，,3,H、,14,C、,32,P的自显影分辨力依次下降。,射线能量低的自显影,射线能量高的自显影,影响分辨力的主要因素：,2、样品的厚度,：,样品厚，组织表面和深层中放射源的射线同时射入乳胶层，使银颗粒分散程度加重，影像重叠，分辨力下降。样品薄，则分辨力高，但曝光时间需加长。,薄样品自显影,厚样品自显影,影响分辨力的主要因素：,3、乳胶层的厚度,：,较薄的乳胶层记录的是离放射源最近的径迹起始部，随乳胶加厚，记录的包括径迹起始部和远离放射源的部分，偏离放射源的机会越多，分辨力下降。,乳胶层厚，形成较大的影像,影响分辨力的主要因素：,4、样品与乳胶层的间隙,：,距离大者，射线散射面积也大，影像越不清晰，分辨力下降。,样品与乳胶层间隙大，形成较大显影,影响分辨力的主要因素：,5、乳胶银晶体大小,：,显影银颗粒不一定于原有的卤化银位置完全一致，故银晶体越小，则显影银颗粒越小，分辨力就越好。,6、曝光时间,：,正常曝光时间，核素中占多数的中、低能量射线作用于乳胶，分辨力高。时间过长，则高能射线作用乳胶几率增加，散射加大，分辨力下降。,7、显影时间,：,显影时间长，可使一些未感光的银粒被还原，使影像界限不清，分辨力下降。,七、放射自显影的本底、效率,1、本底,：,在自显影上，除标本内的放射性核素外，由其他原因造成的显影颗粒，统称自显影的本底。本底过高不仅对低水平放射性的测量，而且降低分辨力。,暗室红灯过量或感光材料在红灯下曝露时间过长、显影液温度过高或时间过长、感光材料过期或保存温度过高、感光材料的机械弯折或涂液体乳胶干燥过快以及感光材料沾污还原性物质等，是引起自显影本底过高的常见原因。,自显影的效率,：,系指待测标本中的放射性核素在曝光时间内，每,100,次衰变所给出的显影银粒数目。,粗略估计，当,3,H标本的厚度为1,m、密度为1.1时，光镜自显影中的效率为10%15%，而厚度为5 m者，效率则为4% 5%（很多深层粒子不能从标本中射出）。,32,P标本在同样条件下的效率为30% 40%，在电镜自显影中，,3,H的效率为25%,。,第二节 放射自显影的基本方法及结果分析,医学生物学示踪研究中的自显影实验，一般环节是：,1、示踪,：向实验动物或离体标本引入放射性核素标记物。,2、标本制备,：取生物标本并制备成含放射性核素的切片、涂片或电泳、层析分离的标本。,3、自显影制备,：暗室中在标本上敷加感光材料。,4、曝光,：避光条件下核射线作用于感光材料。,5、照相处理,：显影、定影、水洗、干燥、染色、封固。最后是,阅读分析,。,一、示踪剂引入的方法,（一）引入途径,（二）引入方法,（一）引入途径,1、,体内实验,：,可由静脉、皮下、肌肉、腹腔或直接脑内注射和灌胃等途径引入放射性标记化合物。,2、体外实验,：对组织、细胞、体液的培养过程，则可在培养瓶中引入。在离体标本上研究受体等生物活性物质，也常将示踪剂直接加在切片上进行结合反应，然后洗去多余的示踪剂后再进行自显影。,二、放射自显影的标本制备,总要求：,标本制备过程不能引起示踪剂的流失或移动,。,（一）组织切片,（二）整体小动物或大动物脏器切片,（三）牙齿、骨骼,（四）体液、培养液中的细胞或其他成分,（五）电镜标本,（六）无细胞的标本,（一）组织切片,1、,冰冻切片,：标本采集后不经固定，直接快速冷冻。冰冻的标本不能反复冻融，直接放置-80备用。然后进行切片，切片冷冻干燥后，移入室温后置4进行自显影。适用于扩散性示踪实验和需保存生物活性的实验。,2、石蜡切片,：标本经固定液固定（福尔马林、多聚甲醛）固定、水洗、脱水、二甲苯浸透、石蜡包埋等过程，常温下切片。标本不宜用含重金属盐的固定液，防止干扰结果。固定后必须充分水洗，制备过程中示踪剂和某些组织成分可能发生扩散或流失，一般只用于非扩散性实验。,（二）整体小动物或大动物脏器切片,实验动物引入示踪剂后，用药物麻醉动物，然后将动物投入干冰丙酮混合液或液氮中快速冷冻，以防组织内形成结晶，待全部冻结，用羟甲基纤维素包埋动物，包埋块在整体切片机上制成切片，再进行自显影操作。,（三）牙齿、骨骼,观察无机成分时，可在磨石上制成磨片。先用10%福尔马林固定，经磨石加水研磨至表面平整的薄片或剖面，然后乙醇脱水、干燥，再进行自显影。观察有机成分时，可脱钙后制成石蜡切片。,（四）体液、培养液中的细胞或其他成分,可直接离心浓缩后制成细胞涂片，培养的细胞也可制备细胞爬片，细胞应制成单层。离体实验中，细胞周围常有大量游离示踪剂，应充分洗涤后再制备涂片。固定涂片的固定液应根据研究对象进行选择，如研究核酸时用甲醇：冰醋酸（3：1），蛋白质则选用10%福尔马林做固定液，干燥后进行自显影。,（五）电镜标本,电镜标本的制备与一般标本制备不同，标本先用2%戊二醛固定，缓冲液洗涤，再用锇酸固定，冲洗，系列丙酮或乙醇脱水，环氧树脂包埋。然后用超薄切片抽切片，切片厚度为50100,m。再涂核乳胶，进行自显影。,（六）无细胞标本,示踪研究所用的各种电泳谱、色层条、免疫沉淀板，可按常规方法进行处理、干燥，然后再用接触法做自显影。,三、自显影制备,（一）接触法,（二）液体核乳胶浸膜法,（三）揭膜乳胶法,（四）融裱法,（五）金属环法,（一）接触法,在暗室中，将标本面与感光胶片或核乳胶干板的乳胶面密切接触，进行曝光而制备自显影的方法称为,接触法,。标本与感光材料均不接触水或有机溶剂，不会造成示踪剂的扩散或流失，适用于各种实验。,（二）液体核乳胶浸膜法,在暗室中，将标本或载有标本的玻片浸入适当稀释的液体核乳胶中，使标本表面敷上一层薄而均匀的乳胶膜，干燥后曝光而制备处显影的方法称液体核乳胶浸膜法。在浸膜过程中，标本要与含水的液体核乳胶接触，会造成扩散性示踪剂一定程度的扩散和流失，故只适用于非扩散性示踪实验。,（三）揭膜乳胶法,将揭膜乳胶膜从玻璃基片上揭下来，在温水中展开，浸透，然后将其贴于标本表面，干燥后曝光而制备自显影。揭膜乳胶厚度均匀，该法常用于光镜自显影的定量研究。因需在水中进行，故适用于非扩散性示踪实验。,（四）融裱法,用预冷的核乳胶干板沾取刚刚切下的冰冻组织切片，并使其贴牢在乳胶面上，冻干后进行曝光制备自显影。主要用于光镜自显影的扩散性示踪实验。,（五）金属环法,电镜自显影常用的方法。即将核乳胶在暗室中按1：4与蒸馏水稀释，40融化并缓慢搅拌1h，存放4过夜使其稳定。然后再融化并搅拌1h，将其冷却到25。用不锈钢制成的金属环（1030mm）插入核乳胶中，垂直提出，在金属环上便形成一层单层乳胶膜。将其敷在电镜切片所放置的铜网上，4曝光制备自显影。,四、自显影的阅读分析,（一）宏观自显影的阅读分析,（二）光镜自显影的阅读分析,（三）电镜自显影的阅读分析,（一）宏观自显影的阅读分析,宏观自显影的影像可直接用肉眼观察。比本底黑的部份即表示放射性示踪剂的存在，黑度越大，表示该处放射性越强，示踪剂分布越多。观察时，需将自显影像与标本重合起来观察，以准确定位。如将自显影像用光密度计进行测量，则可进行定量分析。,（二）光镜自显影的阅读分析,通过在光镜下观察自显影像上银颗粒分布的位置和密度而确定放射性示踪剂存在部位和数量。自显影像上单位面积的显影银颗粒数目，与该处示踪剂的放射性活度呈正比。,光镜自显影的定量分析,二种方法：一是计数被示踪剂标记的细胞或细胞核在细胞群体中所占的百分率，即标记指数。通常一个细胞核上有4个以上银颗粒作为标记细胞。另一种是计数自显影像上某部位单位面积（用显微镜测微尺测量面积）上银颗粒数目，或计数某种组织细胞上的银颗粒数目。,（三）电镜自显影的阅读分析,一般在电镜照片上进行，可以通过银颗粒的位置、数目来确定放射性示踪剂在亚细胞结构的分布，以及数量。,第三节 自显影的应用,放射自显影具有示踪、定位、定量和定时等优点，能准确而精细地将机体的生理功能、生化代谢、增殖等变化与细胞、组织和器官紧密结合起来。在生物医学领域应用范围十分广泛。,一、物质在体内的分布、代谢,用放射性自显影可动态观察生理或病理状态下放射性核素标记的各种药物、毒物、营养物质等在脏器、组织、细胞中的分布、转运、蓄积和排泄，以研究其代谢规律、作用部位及作用机理等。,二、生物活性物质的合成、代谢研究,以适宜的放射性核素标记某些生命物质的前体，如DNA的特异性前体胸腺嘧啶核苷、RNA的特异性前体尿嘧啶核苷、蛋白质的特异性前体氨基酸、类固醇激素的前体胆固醇等，用自显影追踪这些标记前体在组织、细胞中的部位、参入数量、参入时间、影响因素以及合成产物的转运情况等，可能研究各种生物活性物质在体内或细胞中合成、代谢的部位、动态及其机理，还可由此了解细胞功能，应用十分广泛。,三、特异性抗原、受体、DNA片段等的分布,用标记抗体、标记受体的配基或互补RNA（DNA）等，将这些特定的标记物引入体内或与离体组织细胞标本反应，根据这些特定的标记物在体内或标本分布的情况，以揭示与它们有特异亲合力的抗原、受体、DNA片段在组织、细胞中的分布，以进行深入的机理研究。,四、其他方面应用,放射自显影还在分子生物学研究中的限制性内切酶图谱分析、DNA和RNA的序列分析、DNA指纹图谱分析，生物化学中的各种电泳图谱、层析图谱以及免疫学研究中的各种免疫沉淀反应中被用不显示不同处理或反应后标记物的位置和数量。,思考题,一、定义：放射自显影、自显影的分辨力,二、1、放射自显影的原理,2、放射自显影的基本方法,3、放射自显影在生物医学中的应用,三、1、自显影曝光时应在,干燥,、,低温,、,少氧,的环境中进行。,2、衡量自显影的分辨力常用,半距离,表示,3、自显影的类型有,宏观ARG,、,显微镜ARG,和,电镜ARG,4、显影的作用是,使银盐还原为银颗粒,，常用的显影液是,D-19b,，定影的作用是,洗去未感光的银盐,，常用的定影液是,F-5,5、影响自显影分辨力的因素有,核素能量,、,样品厚度,、,乳胶层厚度,、,样品与乳胶层的间隙,、,银晶体的大小,、,曝光时间,和,显影时间,。,ARG在细胞周期研究中的应用,细胞增殖是一个复杂的问题，近年来随着新技术的发展与应用，在细胞形态学研究的基础上，对细胞增殖研究已形成一门新的学科细胞动力学（cell kinetics）。它是研究生物体内各种细胞群体在新生、增殖和消亡过程中处于各种状态时的时间参数、细胞数量、分布位置、细胞迁移等。细胞动力学是生物学中一门研究范围广泛、实用性极强的分支学科。,一、细胞周期,细胞周期（cell cycle）是指从一次分裂结束到下次分裂终止所经历的历程，它包括细胞生长和分裂周期。通常将细胞周期分为四个时相（phase），即DNA合成期（S期）、有丝分裂期（M期）、复制前期（G1期）、复制后期（G2期）。,一个细胞完成有丝分裂后，并非所有细胞都可进入G1期，其中部分细胞不进入下一个细胞周期而处于“静止”状态，这种细胞被称为静止细胞或休止细胞以及G0期细胞,。,无增殖能力细胞或凋亡细胞,死亡,G0期,G1期,2nDNA,S期2-4n DNA,G2期,4nDNA,M期,很久以来，人们就注意到了细胞细胞分裂现象并进行了大量研究。20世纪50年代初，Howard对,32,P-磷酸盐培养的RNA酶处理过的蚕豆尖细胞进行了研究，借助放射自显影技术，首次证明了被标记的细胞不是分裂细胞，而是间期细胞，表明DNA合成是在新时期完成的，并发现在开始标记8h才出现标记的分裂核，持续6h后开始减少。这种变化每30h出现一次，因此提出了细胞周期概念。,20世纪50年代未Quastler和Sherman用,3,H-TdR和放射自显影技术进一步证明了DNA确实在间期合成的，在细胞周期活动中的确存在DNA合成期（S）和细胞分裂期（M）。在S和M期之间以及S期之前，各有一个间隔，分别称为DNA合成后期（G2）和DNA合成前期（G1），进而将细胞周期分为G1、S、G2、M四个时相。,二、常有术语,1、时间参数：,TG1：G1期持续时间,TG2：G2期持续时间,TS： S期持续时间,TM： M期持续时间,TC： 一个细胞周期持续时间,2、指数：,LI：标记指数（标记细胞在群体中所占比例）,GF：生长指数（处于增殖状态细胞在群体中所占比例）,MI：有丝分裂指数（有丝分裂细胞在群体中所占比例）,三、原理,细胞动力学研究，最重要的是对细胞进行标记。胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA的特有前身物，处于S期细胞能摄取TdR合成DNA。将,3,H-TdR或,14,C-TdR放入实验培养体系中，它只能被S期细胞摄取，而不改变DNA分子的生物、化学特性。根据探测到的,3,H或,14,C量可以了解被标记细胞的增殖、分化和消亡规律。,四、方法,（一）一次标记一次取样法,将,3,H-TdR加入细胞培养1530min，洗涤后做放射自显影，计算标记细胞，并按公式计算标记指数（LI）,LI=Ns/Nc,Ns：标记细胞数；Nc：处于细胞周期中的总数,在一个稳定细胞群体中，细胞处于某时相的细胞数量与该时相的时间呈正比，故：,LI=Ts/Tc,（二）一次标记多次取样法,又称有丝分裂百分率法。即一次标记后，在一定时间内多次取样，用放射自显影或液闪测量，观察M期（有丝分裂期）细胞中标记细胞的比例，即有丝分裂标记百分比（PLM）。,PLM=标记M期细胞数/M期细胞总数,以PLM为纵坐标，时间为横坐标可得PLM曲线。,TG2,TM,Ts,Tc,Tc,Ts,TG1,+,TG2,TG2,五、细胞动力学在生物医学中的应用,1、肿瘤细胞的周期化、同步化,2、肿瘤疗效和预后监测,3、用LI检测肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,4、上皮细胞增生性变的细胞动力学监测,5、在实验血液学领域中的应用,谢谢大家！,