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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,1.,获取,cDNA:,(1),厦门大学韩家淮实验室免费提供：,，先在,NCBI,或是其它权威网站上找到你所想要的基因的序列信息，再去上述网址找到他们所提供的序列信息，比对两者之间有无差异，如果完全相同即可立刻用交大邮箱免费申请（快递费用需自付）。如果找不到你所需要的基因序列，或是该实验室提供的序列与你需要的序列不相符，则只能通过其它方法获得。,(2),收集你所需要的基因表达丰度较高的细胞，抽取,RNA,后利用随机引物反转成,cDNA,供使用。,2.,设计引物或是敲除片段：,（,1,）如无特殊需求，引物设计遵从：保护碱基（,4,）,+,酶切位点（,6,）,+,基因序列正向前,20,个碱基,/,反向后,20,个碱基（反向后,20,个碱基需转换为反向互补碱基），如需要从,CDS,序列以外设计引物，则视具体情况不同而定。,（,2,）根据所选用载体上可供选择位点做参考选择酶切位点，需要注意的是你的目的片段中不能够含有与酶切位点相同的序列，如果有，则需要更换不同的酶切位点，否则实验过程中会导致目的片段的剪切从而无法得到所想要的质粒。,（,3,）敲除片段的选择需要利用设计网站如,clontech,，,life-technologies,等网站。,所有引物设计好后发由公司合成，如生工等，周期约,3,天左右。,3.,构建过程,（,1,）,PCR-,聚合酶链反应,利用获取的,cDNA(,菌液或是抽提出其中质粒均可,),作为模板，加入引物，利用扩增酶进行聚合酶链反应，对目的片段进行扩增，扩增之后利用琼脂糖凝胶电泳及,DNA marker,确定条带位置是否正确。最后切胶，利用胶回收试剂盒进行回收，提取凝胶中的目的条带,DNA,。,（,2,）酶切,利用与引物设计时的酶切位点一致的限制性内切酶，切割回收的目,Step1: plasmid construction:10-18days,的片段,DNA,以及载体质粒，使两者暴露黏性末端，为下一步连接做准备。酶切完全后（一般至少,3,小时，最好过夜），同样利用凝胶电泳观察条带是否被完全切开，载体跑胶时需加一道未切割的载体做对照以确定是否被酶切完全（质粒为闭合环状、开环或是线性时跑出来条带的大小各不相同，且容易区分），之后选择正确的位置，切胶，胶回收。,（,3,）连接,利用,T4,连接酶将酶切好的载体与目的片段进行连接，室温,3,小时。,（,4,）转化,将连接好的体系利用热激原理转入细菌感受态中，并通过,37,度摇床小摇,45min,活化感受态，最后铺板，,37,度过夜（,12-14,小时）。,（,5,）小摇,挑取单克隆至,3ml,带抗性的,LB,中，,37,度摇床小摇,8-12,小时。,（,6,）,PCR,验证,利用之前扩增时的相同引物对小摇的菌液,sample,进行,PCR,验证，同时带上模板菌液或是质粒作为阳性对照，并跑胶观察条带进行鉴定。,（,7,）测序,选取,3-5,个,PCR,阳性样品送测序公司进行测序，先测正向反应，等待结果反馈对比后选取正向完全正确及图谱峰值稳定的,sample,再进行反向测序，最后选取测序比对完全正确的,sample,（存在无意义点突变的,sample,也可选择）。,（,8,）扩增,大摇、大抽：取正确的,sample,菌液至,100-150ml,的含抗,LB,中，,37,度摇床大摇,12-14,小时，收集菌液利用大抽试剂盒进行大抽（约需要,4-6,小时）,（,9,）跑胶验证条带并利用,Nanojob,进行核酸定量。,（,10,）抽提出质量及浓度合格的质粒即可以进行后续实验，注意去除内毒素及保证无菌操作。,1ml LB,配方：,Nacl,：,5g,，,Tryptone,：,10g,，,Yeast Extract,：,10g,，配好后分装至锥形瓶中，包好瓶口，高压。,LB,平板：,1ml LB+10g agar,高压后稍作冷却至手温立即加入抗生素并迅速倒板，倒好后将板子密封,4,度保存。抗生素配方：氨苄：,100mg/ml,，,1:1000,使用，高压无菌水配置后分装成,1ml/,支，,-20,度保存。,10 Pfu,扩增酶（,LIFENG,）；内切酶（,NEB,）；胶回收试剂盒、大抽试剂盒（,MN,）；小抽试剂盒（生工）；感受态（,TIANGEN,）；,DNA marker,、,T4 ligase,（,takara,）；,Pbabe-3flag,、,PSIREN,载体 。,250bp,1000bp,2500bp,5000bp,15000bp,10000bp,7500bp,marker,Pbabe-3flag,PSIREN,Gag-pol,VSV-G,ANXA-1,切后,切前,切后,切前,切后,Pbabe-3flag,PSIREN,?,上样量少或是载体放置时间过长,质粒鉴定,酶切鉴定,阳性对照,Sample1,Sample2,Sample3,Sample4,Sample5,Sample6,Sample7,Sample8,PCR,验证, ,在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒,DNA,链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒,：（,1,）,共价闭合环状：,DNA,质粒的两条链没有断裂，超螺旋；（,2,） 开环：,DNA,质粒的一条链断裂，松弛的环状分子；（,3,）线形：,DNA,质粒的两条链均断裂，线性分子。,琼脂糖,DNA,电泳条带位置：线性,开环,共价闭合环状,100bp,1000bp,2000bp,250bp,500bp,750bp,瞬时转染验证质粒：质粒构建好后，再稳转之前先瞬时转染至工具细胞,293T,中做初步验证其有效性：,（,1,）第一天种植,293T,与六孔板中，保证第二天,293T,融合度在,60%-80%,之间；,（,2,）第二天，利用脂质体将质粒转染至,293T,细胞中；,（,3,）,24,小时后，收集,293T,细胞，裂解后提取蛋白，,western,验证。,转染试剂：,polyfect,（,QIAGEN,）,Step2: simple verification by transient transfection: 1-3days,Flag-X,- +,Flag-X,actin,NC shRNA1 2 3 4 5,X,293T,actin,293T,72kd,1.,利用浓度梯度法寻找最适筛选浓度：将待筛选细胞按照,60%-80%,左右融合度种于六孔板中，设置筛选药物如下浓度：,0,，,0.25, 0.5, 0.75, 1, 2g/ml,，加入已贴壁细胞中，每,24,小时观察细胞活率，,3-5,天内细胞全部死亡的最低浓度为最适浓度。,2.,包装病毒步骤：,（,1,）第一天种,293T,于六孔板中，每孔约,60%-80%,融合度；,（,2,）利用,gag-pol,、,vsv-g,包装质粒，用,Xtreme-gene9,转入细胞中，,37,度细胞培养箱培育，,24,小时后换液，,48,小时收病毒上清；,（,3,）收病毒前一天种待感染细胞于六孔板中，每孔,60%-80%,融合度；,（,4,）用的滤头过滤病毒上清后，将病毒上清加入待感染细胞中，加入,polybrene,使其终浓度为,8g/ml,，,1500g,，,22-27,度，,90min,离心；,（,5,）离心后加入培液稀释,polybrene,，放入,37,度培养箱培养；,（,6,）,48,小时后，加入最适浓度抗生素药筛,5-7,天，同时设置对照组参考。,1. VSV-G,是一种包膜蛋白（病毒正是通过包膜蛋白与宿主细胞识别，然后进入细胞），全称是疱疹性口腔炎病毒糖蛋白,G,，因为这个蛋白具有广泛的宿主范围，因此我们在改造病毒载体的时候经常用这种包膜蛋白代替原来病毒中宿主范围较小的包膜蛋白。,2.,受体介导的内吞作用，不会破坏细胞膜。,3.,通常将,VSVG,基因克隆到特定载体上作为包装质粒，与目的基因同时转染,293T,，产生的病毒颗粒可以感染多种人的细胞。,4. gag（,核心蛋白基因），,pol（,复制、整合酶基因）都是病毒的组成部分。,Optimem,（,gibco,）；,Xtreme-gene9(Roche),；滤头（,minipore,）；,polybrene,（,sigma,）；抗生素（,sigma, etc.,）,vsv-g,，,gag-pol,。,Step3: stable transfection and verification: 6-10days,X,actin,NC shRNA1 2 3 4 5,HB,X,actin,NC X,HN13,flag,Step4 : confirm by mRNA expression: 1days,药筛成功后撤药，并扩增阳性细胞，同时离心换液保证细胞状态，细胞长到一定密度后，收集细胞裂解蛋白并,western,验证，同时,冻存细胞保种,。,2 SDS,（甘油，,DTT,，,SDS,配置）；,Bradford,（康为）；溴酚蓝（,ameresico,）；电泳液（甘氨酸、,SDS,、,Tris,配置,10 ,，使用时稀释成,1 ,）；转膜液（甘氨酸、,Tris,配置,10 ,，使用时稀释成,1 ,并加入甲醇）,marker,（,thermo,）；,antibody,（,abcam,、,CST,、,MBL,、,Sigma,）；,SDS,（,sigma,）,PAGE,、（生工）；,APS,、,TEMED,（,ameresico,）；及膜（,minipore,）,
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