沙门氏菌检验详细流程

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,GB,4789.4,-,2010食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验,沙门菌,概况,沙门菌是,1885,年由,Salmon,氏等在猪霍乱流行时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于,Salmon,氏对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门菌属。,沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌有,2500,多个血清型和变种。我国发现的有,250,多个血清型。,沙门菌的分类,根据生化反应不同，分为,2,个种：,肠道沙门菌（,Samonella enterica,） ：,肠道亚种（,subsp. enterica,）,萨拉姆亚种,（,subsp. salamae,）,亚利桑那亚种（,subsp. arizonae,）,豪顿亚种（,subsp. houtenae,）,因迪卡亚种 （,subsp. indica,）,邦戈尔沙门菌（,Samonella bongori,）,沙门菌种和亚种的鉴别,项目,肠道沙门菌,邦戈尔沙门菌,卫矛醇,山梨醇,水杨苷,ONPG,丙二酸盐,KCN,注：,+,为阳性,-,为阴性,沙门氏菌的血清分型,迄今为止沙门氏菌有,57,个,O,抗原,116,个,H,抗原,Vi,抗原,被分成,2500,多个血清型。,Vi,抗原,O,抗原,H,抗原,沙门氏菌命名与书写方式,目前的命名方法规定：,肠道沙门菌肠道亚种（亚种,）给予专用名，并采用标本分离地址的地名。菌名的第一个字母需大写，且亚种,的所用菌名不能用斜体。例如：肠道沙门菌鼠伤寒血清型应书写为,Salmonella enterica subsp.enterica serotype Typhimurium,，但在实际工作中，可简写为,S. Typhimurium,。,其他沙门氏菌均不给专用名，只在亚种数字名后直接书写抗原式，比如,S. 66:z35:-,新的血清型名称的批准必须有巴斯德研究所、德国汉堡卫生研究所及美国,CDC 3,个实验室的一致同意。,沙门氏菌检验程序,目的：修复损伤的细菌细胞；,方法：,25 g,（,mL,）样品,225 mL BPW,的无菌均质杯中，以,8 000 r/min,10 000 r/min,均质,1 min,2 min,，或置于盛有,225 mL BPW,的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打,1 min,2 min,。若样品为液态，,不需要均质，振荡混匀。,如使用均质袋，可直接,进行培养。于,36 ,1 ,培养,8 h,18h,。,前增菌,无菌均质袋,轻轻摇动培养过的样品混合物，移取,1 mL,转种于,10 mL TTB,内,于,42,1 ,培养,18,24 h,。同时,另取,1 mL,转种于,10 mL SC,内,于,36,1 ,培养,18,24 h,。,分别用接种环取增菌液,1,环,划线接种于一个,BS,琼脂平板和一个,XLD,琼脂平板（或,HE,琼脂平板或显色培养基平板）。于,36,1 ,分别培养,18,24 h (XLD,琼脂平板、,HE,琼脂平板、显色培养基平板,),或,40 h,48 h (BS,琼脂平板,),，观察各个平板上生长的菌落。,为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种以上选择性分离培养基。,选择性增菌与分离,分离培养基回收率测定（,%,）,进口,-SS,65.3,进口,-,SS,81.0,国产,-SS,52.0,进口,-HE,83.2,国产,-HE,80.0,进口,-XLD,83.0,国产,-XLD,86.2,进口,-BS,106.6,国产,-BS,77.7,CHRO,显色,68.4,国产,-DHL,98.4,国产,-WS,71.6,TSA,（对照）,100.0,典型菌落,-BS,菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。,国产,BS,进口,BS,典型菌落,-HE,国产,HE,进口,HE,蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。,典型菌落,-XLD,进口,XLD,国产,XLD,菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，,或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心,初筛微生物,菌落颜色,特异性灵敏度,沙门氏菌,紫色,(,直径约,1mm),89,100,%,柠檬酸杆菌属,蓝色,(,直径约,1mm),-,变形杆菌,无色或被抑制,-,(,铜绿假单胞菌也呈紫红色，可以通过前增菌排除。所以推荐在检测中的前增菌用,TTB,。,粉红色、深红色、干燥菌落、边缘锯齿状等 均非沙门氏菌菌落。）,生化试验,自选择性琼脂平板上分别挑取,2,个,以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁（,TSI,）琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板；取菌落一部分于斜面划线后穿刺底层。,接种针在接种,TSI,后不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于,36 ,培养,18,24 h,，必要时可延长至,48 h,。,穿刺,TSI,方法,接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,，,可直接接种蛋白胨水,(,供做靛基质试验,),、尿素琼脂,(pH7.2),、氰化钾,(KCN),培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于,36 ,1 ,培养,18 h,24 h,必要时可延长至,48 h,。,将已挑菌落的平板储存于,2 ,5 ,或室温至少保留,24 h,，以备必要时复查。,沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果,三糖铁琼脂,赖氨酸脱羧酶试验培养基,初步判断,斜面,底层,产气,硫化氢,-,+,（）,（）,可疑沙门氏菌属,-,+,（）,（）,可疑沙门氏菌属,+,+,（）,（）,可疑沙门氏菌属,+,+,/,/,非沙门氏菌,注：阳性，阴性；（）多数阳性,少数阴性；,/,阳性或阴性。,该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。,TSI,的反应 赖氨酸脱羧酶试验,沙门氏菌属生化反应初步鉴别表,反应序号,硫化氢,（,H,2,S,）,靛基质,pH7.2,尿素,氰化钾,（,KCN,）,赖氨酸脱羧酶,A1,A2,A3,/,注：阳性；阴性；,/,阳性或阴性。,反应序号,A1,：为典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、,KCN,和赖氨酸脱羧酶,3,项中有,1,项异常,按下表可判定为沙门氏菌。 如有,2,项异常为非沙门氏菌。,沙门氏菌属生化反应初步鉴别表,pH7.2,尿素,氰化钾,(KCN),赖氨酸脱羧酶,判,定,结,果,甲型副伤寒沙门氏菌,(,要求血清学鉴定结果,),沙门氏菌,或,(,要求符合本群生化特性,),沙门氏菌,个别变体,(,要求血清学鉴定结果,),注：表示阳性；表示阴性。,反应序号,2,：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结果均为阳性；,反应序号,3,：补做,ONPG,，,ONPG,阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌；但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。,沙门氏菌属各生化群的鉴别,必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定,项,目,卫矛醇,山梨醇,水杨苷,ONPG,丙二酸盐,KCN,注：表示阳性,;,表示阴性。,沙门,菌的其他鉴定,API 20E,VITEK32 GNI,卡片,沙门菌的血清学鉴定,培养基：一般使用新鲜营养琼脂斜面作,纯,培养，取斜面上部培养物作,O,抗原玻片凝集试验，下部凝结水里的培养物作,H,抗原。,H,抗原的位相诱导试验,制备半固体琼脂，融化完全分装,10ml/,管，,121 ,灭菌,15,分钟，冷至,50 ,备用。,取诱导用血清,1,滴加到小平皿中，倾入冷至,50 ,的,10ml,半固体琼脂，轻轻摇匀，凝固。,将培养物接种到平板的中央，放入湿盒中培养过夜。取边缘的菌进行,H,抗原的检测。,血清学鉴定时的注意要点：,做血清凝集时，同时应用生理盐水做对照。,O,血清不凝集时，可将菌株转接于琼脂量较高,(,如,2.5%-3%),的斜面上，再做凝集。,如果由于,Vi,抗原的存在而阻止了,O,抗原的凝集反应时，应挑取菌苔于,1mL,生理盐水中做成菌悬液。煮沸后再检查。,(,常见于伤寒沙门菌,),。,有极少数的二相沙门菌会同时出现,2,相,H,抗原，也有一些沙门氏菌在培养过程中,H,抗原会出现第,1,项和第,2,项之间的转变，所以血清诱导实验要用新鲜的培养物进行诱导。,谢谢大家,!,