地中海贫血基因检测和结果分析

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,地中海贫血基因检测和结果分析,主要内容,一、什么是地中海贫血,及分布,二、地中海贫血的致病机制,三、地,中海贫血的基因诊断,四、最新的地中海贫血检测方法,五、检测结果分析及报告,一、什么是地中海贫血,定义：,由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋,白肽链合成减少或缺失，导致血红,蛋白的,链/非,链比例失衡，而引起,的一组遗传性溶血性疾病,，,亦称海洋性贫血,。,血红蛋白病,：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋,白分子的一级结构发生改变，从而导致血红,蛋白的分子结构发生改变的一组遗传性疾病。,地中海贫血是最常见的血红蛋白病,，珠蛋白合成障碍性贫血为国内称呼，国外不用。,地中海贫血分类,地中海贫血分类,1、按照一个单倍型上的,-珠蛋白基因的功能缺陷定义,0,地贫（也有称,地贫1）,：,-珠蛋白基因完全,基因记为-/ 丧失功能。,+,地贫（也有称地贫2）： -珠蛋白基因保,基因记为-/ 留有部分功能。,地中海贫血分类,2、按照肽链内切酶分型,缺失型地贫：珠蛋白肽链存在片段缺失而造,成功能缺陷,非缺失型地贫：珠蛋白肽链上不存在缺失，而是,（点突变）,由于基因的点突变造成的肽链功能,缺陷,地中海贫血分类,3、根据,基因,缺失或突变,个数可分为：,静止型： 缺失1个基因，基因型记为-/,1个基因突变，基因型记为/,T,轻型： 缺失2个基因，基因型记为：-/或-/-,2个,基因突变，基因型记为：,T,/,T,中间型： 缺失3个基因，基因型记为：-/-,缺失与突变混合，基因型为：-/,T,或纯合突变,重型： 缺失4个基因，基因型记为：-/-,缺失与突变混合，基因型为：-/,T,地中海贫血分类,1、根据肽链的功能缺失,0,地贫 ：,珠蛋白基因功能完全丧失，不能合成肽链,地贫 ：,珠蛋白基因尚保留部分功能,2、根据临床症状,静止型地贫： 突变杂合子（ ,N,/ ,+,），中国人少见,轻型型地贫：突变杂合子（ ,N,/ ,+,、 ,0,/ ,N,）,中间型地贫：突变双重杂合子/突变纯合子,（ ,+,/ ,+,、 ,0,/ ,+,）,重型地贫： 突变双重杂合子/突变纯合子,（ ,0,/ ,0,、 ,0,/ ,+,）,中国人HPFH和-地贫的基因突变类型及表型特征,世界地中海贫血的流行分布,广西地中海贫血的流行分布,853,共5789例,224例,834例,790例,1033例,1349例,1559例,Baise,Hezhou,Yulin,Fangchengguang,Liuzhou,Nanning,Xiong , et al. Clin Genet 2010,广西地中海贫血的流行分布,引起,珠蛋白表达降低的常见缺失突变,类型分布, ,MC,10kb,0kb,20kb,30kb,40kb,10kb,3HVR,inter,HVR,5,3, ,2,1,2,1, ,THAI, ,BRIT, ,FIL, ,MED, ,SEA, ,SPAN, ,HW,Black,Belgian,Indian,Malaysian 2,German,Turkish,Italian,Gantonese,Yunnanese,Chinese,Taiwanese,0kb 50kb 100kb 150kb,G,A, ,LCR,引起,地中海贫血,常见的基因缺失突变,类型分步,12 种见于中国人群的,2,/,1,珠蛋白,基因点突变,CD31,CD125,EXON I,EXON II,EXON III,IVS I,IVS,II,UTR,UTR,5,3,CD13,CD59,CD122,CD142,CD44,CD49,CD30,2,1,Missense mutation,Mini deletion or insersion,Termination mutation,Frameshift,CD78,CD74,CD118,启动子突变,异常剪接,起始密码突变,移码突变,无义突变,3UTR突变,EXON 1,IVS 1,EXON 2,EXON 3,IVS 2,显性突变,5,3,46 种见于中国南方人群的,-珠蛋白,基因点突变,中国南方人群最为常见的地贫类型,二、地中海贫血的致病机制,胎儿血红蛋白主要由两条,珠蛋白链、两条,珠蛋白链组成，还含有,链、,链、,链,组成,成年人的血红蛋白由两条,珠蛋白链和两条,珠蛋白链组成,血红蛋白,红细胞,链,链,血红素,铁,链,链,二、地中海贫血的致病机制,11p15.3,珠蛋白基因簇,16p13.3,珠蛋白基因簇,HbA,HS,40 , ,2,1,2,1,HS 5 4 3 2 1 ,G,A, ,二、地中海贫血的致病机制,人体不同发育时期的珠蛋白生成变化规律,二、地中海贫血的致病机制,静态突变,点突变,片段突变,动态突变,碱基替换,移码突变,串联重复的三核苷酸序列随着世代的传递而拷贝数逐代累加,缺失,重复,重排,基因突变的分子机制,基因致病突变是地贫发生的分子基础,二、地中海贫血的致病机制,三、地,中海贫血基因分析,1、Gap-PCR 用于,和,等,缺失型地贫的检测,2,1,1,2,1,1,SEA,3.7,4.2,A,B,C,D,E,F,G,原理：普通的酶无法扩增出长距离的片段，通过设计出与缺失序列的两侧翼序列互补的引物，当存在缺失时，由于肽链靠近从而扩增出片段。,三、地,中海贫血基因分析,2、PCR-RDB,用于检测,和,点突变,PCR,膜条,杂交,显色,三、地,中海贫血基因分析,地贫基因检测的策略：,地贫：先检测常见缺失型，然后检测非缺失（点,突变），最后是未知的缺失和突变位点。,因为90%,地贫为常见的三种缺失型,（-sea,-3.7,-4.2)。,地贫：先检测点突变，然后检测少见的缺失型。,大部分,地贫都是点突变型。,血红蛋白病的筛查及基因诊断的技术流程,遗传咨询,产前地贫携带者筛查策略,同时正常,产检对象（孕妇及其配偶）,地贫分子诊断,知情同意选择,胎儿产前基因诊断,血液五分类分析（关注,MCV和MCH,）+血红蛋白电泳（Hb A2),双方某项指标,均同时降低,一方正常，另一方的指标,降低,地贫全套检查,异常的一方做地贫全套检查,-,地贫特征,-,地贫特征,ID,双方均为,-,地贫特征,一方为-地贫特征，另一方为ID或-地贫特征,+,-,单纯性ID或单纯性,-地贫,双方均为,-地贫特征,ID或-地贫特征的一方,做地贫分子诊断,夫妇双方基因诊断,血R正常的,一方做,地,贫分子诊断,-,单纯性ID或单纯性,-地贫,-,+,+,仅异常血红蛋白,必要时测序或选择其中一种地贫检测,四、最新的地中海贫血检测方法,1、融链曲线分析法,用于检测,或,缺失和点突变,Thongperm, et al. Journal of Molecular Diagnostics .2010,Xiong F, et al. J Mol Diagn. 2011,Christina V，et al. Clinical Chemistry. 2003,原理：根据每条肽链都有自己的Tm值，从而可以通过温度差来判断,四、最新的地中海贫血检测方法,2、MLPA（多重连接探针扩增）,用于寻找未知缺失断裂点,Xiao-Feng Wei，et al. Ann Hematol. 2011,四、最新的地中海贫血检测方法,3、毛细管电泳,可以检测,非缺失CS（Hb CS)和,E,地贫,Hb A,Hb E,Hb A2,Can Liao, et al. European Journal of Haematology. 2010,四、最新的地中海贫血检测方法,4、DHPLC（变性高效液相色谱）,用于缺失型和突变型地贫都可以,李倩，南方医科大学论文，2010,四、最新的地中海贫血检测方法,5、基因序列测定（PCR+毛细管电泳）,用于未知突变位点或确定缺失片段的位置,由于仪器比较贵重，技术要求高，目前尚未在临床一线,推广，只在科研实验室里开展。,Azam Amirian MSc， et al. Archives of Iranian Medicine. 2011,四、最新的地中海贫血检测方法,6、母体血浆中胎儿游离核酸的测定,严提珍，国际输血及血液学杂志，2009,严提珍，国际输血及血液学杂志，2009,五、检测结果分析及报告,（,一,）地贫基因诊断,1、 - -,SEA,/,2、,/,3、,/,4、- -,SEA,/-,5、- -,SEA,/-,6、- -,SEA,/-,7、,/,8、,- -,SEA,/,9、,DNA Marker,缺失型地贫电泳结果,1 2 3 4 5 6 7 8 9,非缺失杂交结果,CS纯合,WS杂合,未检测到,6,种突变,（注意不是正常）,28,/,N,IVS-II-654,/,N,CD17,/,N,CD4142,/,N,28,/,28,CD17,/,IVS-II-654,A,B,C,D,E,F,地中海贫血点突变分析结果,血涂片染色（包涵体）,Cornelis L H，,Orphanet Journal of Rare Diseases， 2010,五、检测结果分析及报告,（三）基因诊断报告单,1、临床地贫基因报告,主要是常规试剂可以检测到的类型，一般都会包括被测样本的信息，检测方法，检测试剂，检测者的签名，诊断结果以及临床提示。,2、临床科研报告,由于常规检测不到，但是患者又必须进一步检测确定的罕见或未知地贫类型。报告信息只包括被测样本信息，检测方法，检测试剂，诊断结果及临床提示，,没有检测者的签名（不承担法律后果）,。,地贫基因分析诊断报告单（ alpha 地贫）,新修改的报告单,珠蛋白基因缺失和发生的三联体基因座的分子机制,谢 谢,The End,谢谢您的聆听！,期待您的指正！,