临床生物化学检验 诊断酶学

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章,诊断酶学,卫生部,“,十二五,”,规划教材 全国高等医药教材建设研究会规划教材,首都医科大学,王培昌,教学内容,一、酶的概念与特征,（一）酶的组成、结构与功能,1.,酶的本质和特征,2.,酶的结构和功能,（二）酶的催化作用机制,1.,酶活性中心是酶分子执行催化功能部位,2.,酶反应的诱导契合学说,（三）酶的命名,1.,习惯命名法,2.,系统命名法,（四）酶的分类与编号,第一节 概述,（一）酶的组成、结构与功能,1.,酶的本质和特征, 酶的化学本质：绝大部分的酶是蛋白质，有些酶是核酸和酶蛋白 组成的复合体，极少数酶是核酸。, 酶除了具有蛋白质的理化性质、一般催化剂的共同性质外，还具 有极高的催化效率、高度的特异性（,specificity,）及催化作用的可调节性等特点。, 由酶所催化的反应称为酶促反应。,酶促反应过程中的几个概念：,酶活性,（,activity,） ；,底物,（,substrate,）；,产物,（,product,）；,激活剂,（,activator,）；,抑制剂,（,inhibitor,）,核酶,（,ribozyme,）：具有催化作用的核糖核酸。,2.,酶的结构和功能, 酶和一般蛋白质一样，具有一、二、三乃至四级结构。,单体酶,（,monomeric enzyme,）,寡聚酶,（,oligomeric enzyme,）,多酶体系,（,multienzyme,）,多功能酶或串联酶,（,tandem enzyme,）,单纯酶,（,simple enzyme,）：仅由氨基酸残基构成的酶。,结合酶,（,conjugated enzyme,）：除含蛋白质外，还含有非蛋白部分（金属离子或小分子有机化合物），前者称为酶蛋白，后者称为辅因子。,（二）酶的催化作用机制,1.,酶活性中心是酶分子执行催化功能部位,酶分子中能和底物特异结合并将底物转化为产物的区域称为,酶的活性中心,（,active center,），酶活性中心是由空间上彼此靠近的化学基团组成的具有特定空间结构的区域。,2.,酶反应的诱导契合学说,（,induced fit hypothesis,）,在酶促反应中，酶与底物结合时，底物首先和酶分子上的活性中心相结合，形成酶,-,底物中间复合物（,ES,）。在构象上相互诱导，致使活性中心与底物完全紧密结合，这一过程称为,诱导契合学说,。,（三）酶的命名,1.,习惯命名法,根据酶所催化的底物、反应的性质以及酶的来源等进行命名。此法虽较简单，但缺乏系统性，易造成混乱。,2.,系统命名法,国际酶学委员会于,1961,年提出了酶的系统命名法（又称,EC,命名法）。规定每一酶均有一个系统名称，它标明酶的底物与反应性质，底物名称之间以“,”,分隔开。,（四）酶的分类与编号,1.,根据酶所催化反应类型可将酶分为六大类，即：,氧化还原酶类,（,oxidoreductases,）,转移酶类,（,transferases,）,水解酶类,（,hydrolases,）,裂解酶类,（或裂合酶类）（,lyases,）,异构酶类,（,isomerases,）,合成酶类,synthetases,或连接酶类,(ligases,）,2.,国际酶学委员会将每种酶用,4,个数字加以系统编号。数字前冠以,EC,，数字之间用黑点隔开。第一个数字表示酶的类别，第二个表示亚类，第三个表示亚,-,亚类，第四个表示酶的编号序数。,二、同工酶的概念与特征,(,一,),同工酶的概念与特征,同工酶,是指催化相同化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。,同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，使不同的组织、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征，这为同工酶用来诊断不同器官的疾病提供了理论依据。,(,二,),同工酶分类与命名,分类 根据同工酶的来源和结构不同，从基因角度可将其分为：单基因决定的同工酶、复等位基因同工酶、多基因决定的同工酶和修饰的同工酶等四类。,命名 至今尚无确切的方法，常以组织名称、亚基的数目和组成或发现地地名等命名。,酶,同工酶种类,相关疾病,CK,CK-BB,CK-MB, CK-MM(CK,1,CK,2,CK,3,),心梗、肌病、颅脑损伤、肿瘤,LD,LD,1, LD,2, LD,3, LD,4, LD,5,心梗、肌病、肺梗死、肝病、肿瘤,ALP,肝，小肠，骨，胎盘，肾,肝胆疾病、骨病、妊娠、结肠炎、肿瘤,ACP,红细胞，前列腺，溶酶体,前列腺癌、血液病、骨肿瘤,-GT,-GT,1, -GT,2, -GT,3, -GT,4,肝癌、梗阻性黄疸,AMY,P-AMY(P,1,P,2,P,3,), S-AMY(S,1, S,2, S,3,S,4,),急、慢性胰腺炎、腮腺炎,ALT,ALTs, ALTm,心梗、肝病,AST,ASTs, ASTm,心梗、肝病,GP,GP-BB, GP-LL, GP-MM(GP,1,GP,2,GP,3,),心梗、脑损伤、肾病、肌病,GST,GST,1,和,GST,2,(GST-), GST,3,(GST-), GST,4,和,GST,5,(GST-),肺癌、肝炎,ALD,ALD-A, ALD-B, ALD-C,肝癌、肝炎、神经细胞癌,NAG,NAG-A, NAG-B, NAG-I,肝病、肾病,人体中几种重要的同工酶,三、工具酶,（一）工具酶参与的指示反应,（二）,酶循环法,（三）代谢物浓度的酶法测定技术,1.,终点法,（,1,）直接法,（,2,）酶偶联法,2.,动力学法,(,一,),工具酶参与的指示反应,通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为,工具酶,。常用工具酶多为氧化还原酶类。,在临床生化检验中，许多项目的测定均有工具酶参与，最常用的有两类分光光度法：,一类是利用较高特异性的氧化酶产生过氧化氢（,H,2,O,2,），再加氧化发色剂比色；,另一类是利用氧化,-,还原酶反应使其连接到,NAD(P)-NAD(P)H,的正,/,逆反应后，直接通过分光光度法或其他方法测定,NAD(P)H,的变化量。,(,二,),酶循环法,酶循环法,（,enzymatic cycling methods,）采用两类工具酶进行循环催化反应，使被测物放大扩增，从而使检测灵敏度提高。目前临床上已应用于总胆汁酸的测定。,为了简化操作过程，并使酶试剂得以方便或反复使用，已有许多研究将水溶性的酶通过吸附、包埋、载体共价结合或通过酶分子间共价交联等方法固定在支持物上，并保持其原有的活性，这样制备的酶称为,固相酶,（或固定酶）（,immobilized enzymes,）。,（三）代谢物浓度的酶法测定技术,1.,终点法,在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后反应趋于平衡，测定反应达到平衡后待测物（底物）或产物变化的总量，即,终点法,（又称平衡法）。,(1),直接法,：,如果待测物与产物在理化性质上有可直接进行检测的差异，如吸收光谱不同，则可直接测定待测物或产物本身信号的改变来进行定量分析,.,(2),酶偶联法,：,如果酶促反应的底物或产物无可直接检测的成分，则可将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，而达到检测的目的，即为酶偶联法。,代谢物酶促终点法测定的基本条件是：,待测物浓度,S,应远小于其米氏常数,Km,，此时任何时刻的反应速率,V=VmaxS / Km,，呈一级反应；,反应配方中所用酶量（,V,）应足够大，而,Km,应小，以保证有较快的反应速度完成测定。,终点法测定的实验设计中，主要应考虑以下问题,：,（,1,）工具酶的特异性：,（,2,）,Km,大小要合适：,（,3,）酶的用量,（,4,）工具酶中的杂酶应低于允许限。,（,5,）反应平衡点：,（,6,）附加剂：应不抑制酶的活性,2.,动力学法,根据米氏方程，当,SKm,，一般，最好，,S+KmKm,，此时呈一级反应，反应初速度,v=kS,。如果能准确测定反应的初速度（,v,），采用标准浓度对照法即可求得待测物的浓度。,酶活性测定,酶学测定方法,酶质量测定,固定时间法（,fixed time assay,）,连续监测法（,continuous monitoring assay,）,第二节 酶测定技术,一、酶活性测定,（一）定时法测定酶活性,（二）连续监测法测定酶活性,（三）干扰因素,（四）血清酶活性浓度测定的条件的优化,（五）部分分析前因素对酶活性测定的干扰,（六）酶活性浓度的单位,（七）系数,K,值的计算与应用,（八）临床酶学测定的标准化,(,一,),定时法测定酶活性,定时法是根据固定时间内底物消耗量或产物的生成量计算酶活性，这是早期测定酶活性浓度的方法。用定时法准确测定酶活性浓度，必须了解不同酶促反应速率和时间的关系，应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间，然后在这段时间进行测定，避开延滞期和一级反应。,定时法中可能引起的误差,(,二,),连续监测法测定酶活性,连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为,连续监测法,。,1.,直接法,在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、,pH,、电导率、粘度等计算出酶活性浓度。,只有底物与产物之间，在理化性质等方面有显著差异时，才能使用直接法。,2.,间接法,采用酶偶联反应是间接法测定酶活性的主要技术特点。,(1),最简单的酶偶联反应（单底物反应且只有一个工具酶）模式为：,Ex,：被测定酶,C,：被检测物质,Ei,：指示酶,Ex,催化的反应称为始发反应，产生被检测物质产物,C,的反应称为指示反应。,(2),如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连接起来，此反应称为辅助反应。模式为：,一般习惯将最后一个酶称指示酶,Ei,，其他外加的酶称为辅助酶（,Ea,）。,(3),偶联反应中存在几个时相：,预孵育期,：反应一开始只存在底物,A,，不存在指示酶的反应。,延滞期,：加入底物启动反应，在启动后的一段短时间内，产物,B,开始出现并逐渐增加，但仍处于较低水平，指示酶反应速度也较低，不能代表测定酶的反应速率,Vx,。,稳态期,：产物,B,增加到一定程度时，,Ex,和,Ei,催化的反应速率相同，达到了稳态期。此阶段特定波长处（如,340nm,）吸光度才会有明显的线性变化。,酶偶联法测定,ALT,的吸光度变化,(4),指示酶的选择,Vx/(Km)x=Vi/(Km)i,Vi,：指示酶的用量,Vx,：测定酶的测定上限,(Km)x,：分别是测定酶,(Km)i,：指示酶的米氏常数,米,-,曼氏方程,在酶偶联反应中，指示酶催化反应速率,Vi,的计算公式为：,式中,Vx,为测定酶的测定上限，,(Km)i,为指示酶的米氏常数，,P,为中间产物浓度。,McClure,介绍的另一种近似计算法计算延滞期时所需指示酶的量。,假定酶偶联反应如下：,第一个反应为零级反应，第二个反应为一级反应。如测定时间很短，,C,浓度不高时，指示酶催化反应速率,Vi,可通过下列公式进行计算：,式中,t*,表示延滞时间，,(Km)i,为指示酶的米氏常数，,F,b,是在,t*,时产物,B,为其稳态浓度的百分数，一般选用。,(,三,),干扰因素,1.,其他酶和物质的干扰,2.,酶的污染,3.,非酶反应,4.,分析容器的污染,5.,沉淀形成,(,四,),血清酶活性浓度测定的条件的优化,测定酶活性浓度方法所选择的测定条件应是酶促反应的“最适条件”，即指在所选择温度下能使酶促反应的催化活性达到最大。主要与下述一些因素有关：,如底物、辅因子、活化剂、缓冲液和变构剂种类和浓度；,指示酶和辅助酶的种类和浓度；,反应混合液的,pH,和离子强度；,其他可变因素，如已知抑制剂的去除。,1.,方法选择 尽可能采用连续监测法；尽量减少操作步骤。,2.,仪器和设备 明确规定仪器和设备的各种性能规范。,3.,试剂 化学试剂必须具有一定纯度；试验用水最好是纯水或双蒸水。,4.,自动生化分析仪参数的设置,（,1,）,方法类型,终点法或连续监测法。反应方向分正向,/,向上,/+,（吸光度增加）或负向,/,向下,/-,（吸光度减低）。,（,2,）,波长,选择酶促反应体系吸光度最大的波长,（,3,）,样品量与试剂量,应考虑测定的灵敏度和测定上限选用合适的样品与试剂体积比。一般推荐样品与试剂体积比为,1:10,。,（,4,）,稀释水量,（,5,）,反应时间,线性反应时间范围愈宽者，愈适于临床应用。,（,6,）,孵育时间,（,7,）,延迟时间,（,8,）,监测时间,酶活性测定的连续监测法至少,90120s,或至少,4,点（,3,个,A,），少于,3,个,A,不能称为连续监测法，因为不能计算线性度（不知是否为线性反应）。,（,9,）,试剂吸光度上、下限,（,10,）,底物耗尽限额,（,11,）,线性度,（,12,）,试剂空白速率,（,13,）,线性范围,按试剂质量而设置，超过范围应增加样品量或稀释后重测。,（,14,）,计算因子,F,值（或系数,K,）,(,五,),部分分析前因素对酶活性测定的干扰,1.,溶血,部分酶在红细胞膜或红细胞内的浓度远高于细胞外（如乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、己糖激酶等），少量血细胞的破坏就可能引起血清中酶明显升高。,2.,抗凝剂,草酸盐、柠檬酸盐和,EDTA,等抗凝剂为金属螯合剂，可抑制需,Ca,2+,的,AMY,，也可抑制需,Mg,2+,的,CK,和,5-NT,；,草酸盐既可与丙酮酸或乳酸发生竞争性抑制，又能与,LD,及,NADH,或,NAD,+,形成复合物，从而抑制催化的还原或氧化反应。,柠檬酸盐、草酸盐对,CP,、,ChE,均有抑制作用。,3,.,标本储存温度,大部分酶在低温中可稳定较长时间，标本如在离体后不能及时测定，应及时分离血清或血浆并置冰箱冷藏,。,酶,室温（,25,）,冷藏（,04,）,冰冻（,-25,）,LD,1,周,13d,13d,-GT,2d,1,周,1,月,ALD,2d,2d,不稳定,*,ALT,2d,5d,不稳定,*,AST,3d,1,周,1,月,CK,1,周,1,周,1,月,ChE,1,周,1,周,1,周,ALP,23d,23d,1,月,ACP,4h,3d,#,3d,#,-NT,24h,1,周,3,月,AMY,1,月,7,月,2,月,LPS,1,周,3,周,3,周,LAP,1,周,1,周,1,周,不同贮存温度时体液酶的稳定性（活性变化小于,10%,）,*,酶不耐融化；,与同工酶类型有关；,标本未酸化；,#,标本加枸橼酸或醋酸至,pH 5,(,六,),酶活性浓度的单位,1.,酶活性单位,（,1,）惯用单位,（,2,）国际单位,（,3,）,Katal,单位,1979,年国际生化协会为了使酶活性单位与国际单位 制（,SI,）的反应速率相一致，推荐用,Katal,单位（也称催量，可简写为,Kat,）。即在规定条件下，每,s,时间内催化转化,1,摩尔底物的酶量，,1katal=1mols,-1,。,我国法定计量单位制中的酶催化活性单位为,katal,，其对血清中酶量而言显然过大，故常用单位为,katal,或,nkatal,。,1katal=6010,6,U,，,1U=1molmin,-1,=16.67nmols,-1,。,2.,酶活性浓度单位 临床上测定的不是酶的绝对量而是浓度。酶活性浓度以每单位体积所含的酶活性单位数表示。,（,1,）表示方法 目前在临床化学中，各国学者几乎都习惯用,U/L,来表示体液中酶催化浓度。,（,2,）酶活性浓度单位的计算 用连续监测法进行酶活性测定时，不需作标准管或标准曲线，根据摩尔吸光系数很容易进行酶活性浓度的计算。,摩尔吸光系数,（,）的定义为：在特定条件下，一定波长的光，光径为时，通过所含吸光物质的浓度为,1.00 mol/L,时的吸光度。,如用连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化（,A/min,），以,U/L,表示酶活性浓度时，则可按下式进行计算：,式中：,V,反应体系体积（,ml,）,摩尔吸光系数（,cm,2,mol,-1,）,v,样品量（,ml,）,L ,比色杯光径（,cm,）,A,吸光度变化,10,6,将,mol,换算成,mol,3.,参考区间和正常上限倍数的应用,（,1,）参考区间,由于临床实验室进行酶学测定时所选仪器、试剂和方法不同，加之生物学变异等对酶活性影响，常常导致实验室之间所得参考区间差别甚远，应根据各自情况对各种酶建立自己的参考区间。表,5-4,列举了几种临床常用酶的成人参考区间。,（,2,）正常上限倍数的应用,正常上限倍数,是指把酶测定值转换为正常上限值的倍数。在分析酶学报告时，除传统测定的报告方式（,U/L,）外，也提倡用正常上限（,upper limits of normal, ULN,）倍数作为酶活性浓度的表示法。,临床常用血清酶的测定方法与参考区间,（,37,）,*,国际临床化学联合会（,IFCC,）参考方法；,#,实际为拟胆碱酯酶（,PChE,）,酶,方法,参考区间,ALT,连续监测法 底物中含磷酸吡哆醛,底物中不含磷酸吡哆醛,男：,45U/L,；女：,34U/L*,540U/L,AST,连续监测法 底物中含磷酸吡哆醛,底物中不含磷酸吡哆醛,男：,35U/L,；女：,33U/L*,840U/L,ALP,连续监测法（磷酸对硝基苯酚法）,112,岁,500U/L,；,男：,1215,岁,750U/L,，,25,岁,40150U/L,；,女：,15,岁,40150U/L,ACP,比色法（磷酸麝香草酚法）,0.51.9U/L,LD,连续监测法,L,P,，即,LD-L,法,P,L,，即,LD-P,法,252U/L*,200380U/L,CK,连续监测法（酶偶联法）,男：,169U/L,；女：,143U/L*,-GT,连续监测法（,L-,-,谷氨酰,-3-,羧基,-,对硝基苯胺法）,连续监测法（,L-,-,谷氨酰,-,对硝基苯胺法）,男：,55U/L,；女：,38U/L*,男：,50U/L,；女：,30U/L,AMY,连续监测法,对,-,硝基苯麦芽庚糖苷（,4NP-G,7,）法,220U/L,LPS,固定时间法（乳化液比浊法）,110U/L,ChE,#,连续监测法（丁酰硫代胆碱法）,5 00012 000U/L,(,七,),系数,K,值的计算与应用,在实际工作中，特别是用自动生化分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上来讲,V,、,v,和,L,均为固定值，,为常数，则将上述公式可简化为：,K,为,酶活性浓度定量系数,（或称为常数），主要用于临床酶活性测定的计算与校准。,1.,系数,K,值的意义与设置,系数,K,值对于酶的测定十分重要，过高虽然测定的线性较宽，但重复性差，反之，虽然精密度好，但检测线性窄。,K,值的设置应考虑测定酶的参考范围上限及测定时间两方面，以保证测定结果的可靠。,2.,系数,K,值的类型与计算,系数,K,值只能供用户通过计算式及求实测,K,值时参考，不能直接用于酶活性浓度的计算。,常用指示物的摩尔消光系数（,cm,2,mol,-1,）与用途,指示物,主波长,次波长,用途,NADH,340nm,6.2210,3,380nm,1.3310,3,测,ALT,、,AST,、,LD,、,-HBD,等,NADPH,340nm,6.2210,3,380nm,1.3310,3,测,G6PD,、,CK,对硝基苯酚,405nm,18.510,3,476nm,0.2010,3,测,ALP,对硝基苯胺,405nm,9.910,3,测,-GT,5-,硫代,-2-,硝基苯甲酸,405nm,13.610,3,476nm,2.8010,3,测,ChE,(,八,),临床酶学测定的标准化,1.,标准化途径 通过使用推荐方法和参考方法，以及使用公认的酶校准物或酶参考物等，使酶学测定标准化。,（,1,）,使用推荐方法和参考方法,我国于,1994,年发表了,测定人血清（血浆）中酶催化浓度方法总则,，并于,1995,年、,1996,年相继通过了,ALT,、,-GT,、,CK,、,LD,、,ALP,、,AST 6,项推荐方法草案。卫生行业标准,临床酶活性浓度测定方法总则,（编号,WS/T222-2002,）也已由卫生部批准实施。,（,2,）,使用公认的酶校准物或酶参考物,酶测定中最理想的校准方法是用稳定的、定值准确的酶校准物或酶参考物对测定全过程进行校准。,2.,酶活性浓度测定的参考系统,IFCC,于,1998,年决定建立包括下列要素的测定酶催化浓度的参考系统：,参考测定方法，以现有的,IFCC 30,的参考方法作为基础，制定了一套,37,的标准操作方法（,SOPs,）；,参考实验室网络，选择一组参考实验室（包括厂家实验室），为之提供必要的技术和仪器，使之在计量学高水平上按参考测定方法（,SOPs,）进行测定；,参考物，参考实验室网络对现有的,BCR,参考物进行重新认证。,建立原级参考方法,制备原级参考物,建立参考实验室网络,二、酶质量测定,（一）免疫化学法测定酶质量原理,利用酶蛋白的抗原性，制备特异性抗体，然后以免疫学方法测定酶蛋白质量。质量单位多以,ng/ml,、,g/L,来表示。,1.,放射免疫测定,（,RIA,）,分为直接法与间接法。,直接法是将放射性核素标记的酶分子与相应抗体作用产生沉淀，然后将沉淀分离并进行定量测定。,2.,其他方法,主要有免疫抑制法、化学发光免疫测定（,CLIA,）、酶免疫测定（,EIA,）、荧光酶免疫测定（,FEIA,）等。国内曾有用免疫沉淀法（单向扩散法）测定酶活性的报告，如超氧化物歧化酶（,SOD,）测定。,（二）酶质量免疫化学测定法的优缺点,与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的,优点,主要有：,灵敏度高，能测定样品中用原有其他方法不易测出的少量或痕量酶；,特异性高，几乎不受体液中其他物质，如酶抑制剂、激活剂等,的影响；,能用于一些不表现酶活性的酶蛋白，如各种酶原或去辅基酶蛋,白，或因遗传变异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定；,特别适用于同工酶的测定。,酶免疫化学测定,局限性,：,要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的，且工作量较大；,测定步骤多，操作繁琐；,测定成本高。,三、同工酶检测,临床同工酶（或亚型）的分析大致可分为两步，即首先精确地分离,出某酶的各同工酶（或亚型）组分，然后测定酶的总活性和各同工酶,（或亚型）组分的活性。,常用同工酶（或亚型）的分析方法,方法,同工酶（或亚型）的性质差异,同工酶、亚型,电泳法,（区带电泳、等电聚焦）,电荷不同,所有同工酶、亚型,层析法,（离子交换层析、亲和层析）,电荷不同,CK,、,LD,、,ALP,免疫分析法,免疫抑制法,特异性抗体反应性不同,CK,、,LD,、,ACP,免疫化学测定法,（,RIA,、,EIA,、,FIA,、,CLIA,）,特异性抗体反应性不同,CK,、,LD,、,ACP,、,ALP,、,AMY,动力学分析法,底物特异性分析法,底物,Km,、亲和力不同,ACP,、,CK,、,LD,（,-,羟丁酸）,抑制剂分析法,对小分子量的抑制剂的特异性抑制不同,LD,（草酸）、,ACP,（,L-,酒石酸）、,ALP,（尿素和,L-,苯丙氨酸）、,ChE,（氟和可卡因）,pH,分析法,最适,pH,不同,AST,热失活分析法,热稳定性不同,ALP,（一）电泳法,同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率也就不同，据此可用电泳法分离鉴定。,常用于分离同工酶电泳方法有醋酸纤维素薄膜电泳,(CAE),、琼脂糖凝胶电泳,(AGE),、聚丙烯酰胺凝胶电泳,(PAGE),等。,以,LD,同工酶为例,，,H,亚基含酸性氨基酸比,M,亚基多，在的碱性缓冲溶液中带负电荷较多，电泳速度比,M,亚基块，电泳结束时由正极向负极依次有,LD,1,、,LD,2,、,LD,3,、,LD,4,、,LD,5,共五条同工酶条带。电泳结束后，可用含乳酸、,NAD+,、酚嗪二甲酯硫酸盐,(PMS),和氯化硝基四氮唑蓝,(NBT),的染色液将区带染色，染色原理为：,LD,催化乳酸脱氢，脱下的氢由,NAD+,传递给,PMS,，再由,PMS,传递给,NBT,，,NBT,还原为紫红色的化合物而使区带染色。染色后洗脱支持介质背景染料，用光密度扫描仪扫描区带，或将区带切下洗脱比色测定。,正常和几种病理状况时血清,LD,同工酶的琼脂糖凝,胶电泳分离图谱,用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。,巨分子酶形成的原因主要有,：,酶与免疫球蛋白形成的复合物，如,CK-BB-IgG,、,CK-MM-IgA,、,LD-IgA,等；,酶与其他蛋白质形成的复合物，如,LD-,脂蛋白等；,酶亚基或酶分子之间形成的聚合物，如,CK-Mt,聚合物、,LD,亚基自身聚合等。现已有关于,CK,、,LD,、,AST,、,AMY,、,-GT,和,ALP,等巨分子酶的报道。如，将可疑血清进行琼脂糖凝胶电泳结合荧光染色扫描分析，发现巨,CK,1,位于,CK-MM,与,CK-MB,之间，巨,CK,2,位于,CK-MM,的阴极侧（图,5-4,）。,正常和病理状况时琼脂糖凝胶电泳分析血清,CK,同工酶可能出现的酶带,（二）层析法,离子交换层析和亲和层析等常用于同工酶的提纯与制备，也可用于临床同工酶常规检测。,同工酶分子荷电量不同是离子交换层析法分离的基础，常用的离子交换剂有二乙氨基乙基纤维素,(DEAE-C),、二乙氨基乙基葡聚糖,A-50(DEAE-Sephadex A-50),、二乙二羟丙氨乙基葡聚糖,A-50(QAE-Sephadex A-50),等。,（三）免疫分析法,由于同工酶的一级结构不同，因而免疫化学性质也不同。利用纯化的同工酶免疫动物制备特异性的抗血清，此抗体只与该同工酶产生特异性免疫反应。因此，抗原决定簇不同的同工酶可用特异的免疫反应来识别。应用较多的免疫分析法有免疫抑制法、免疫沉淀法等。,（四）同工酶的其他分析方法,1.,底物专一性分析法,不同的同工酶底物专一性不同，,Km,值也不同，如同工酶之间,Km,差别足够大，可通过测定其,Km,值加以鉴定。（例：,AST,）,2.,选择性抑制法,同工酶各亚型对抑制剂敏感程度不同，或同一抑制剂对不同同工酶有不同的抑制作用。（例：前列腺释放的酸性磷酸酶,ACP,）,3,. pH,分析法,不同同工酶可有不同的最适,pH,，如同工酶之间最适,pH,差别足够大，可通过调节缓冲液,pH,，使待测同工酶维持完整活性的同时，其它同工酶活性受到抑制。,4.,热失活分析法,利用不同同工酶的耐热性不同进行分析与鉴定。（例：,CK,）,一、血清酶,（一）血清酶的来源与去路,1.,血清酶的来源,2.,血清酶的去路,血清酶的半寿期是指酶失活至原来活性一半时所需时间（,T1/2,），一般以半寿期来代表酶从血中清除的快慢。,细胞酶,外分泌酶,非血浆特异酶,血浆特异酶,血清酶,在血浆中发挥特定的催化作用的酶,来源于消化腺或其他外分泌腺的酶,存在于各组织细胞中进行代谢的酶类,第三节,常用酶及同工酶测定的临床应用,几种血清酶的半衰期与分子量,酶,半寿期,相对分子量,ALT,37,57h,110 000,AST,12,22h,ASTs,约,14h,120 000,ASTm,约,6h,100 000,CK,约,15h,CK,1,(CK-BB),约,3h,88 000,CK,2,(CK-MB),约,10h,87 000,CK,3,(CK-MM),约,20h,85 000,LD,LD,1,53,173h,135 000,LD,5,8,12h,135 000,ALP,3,7d,120 000,肠,ALP,1h,骨,ALP,约,40h,胎盘,ALP,约,170h,GLD,约,16h,350 000,AMY,3,6h,LPS,3,6h,48 000,-GT,3,4d,（二）血清酶的生理差异,1.,性别,多数血清酶的男女性别差异不大，但少数酶如,CK,、,ALP,及,-GT,等有性别差异，男性高于女性。性别差异也见于同工酶，年轻女性因含雌激素较多，血清,LD,1,含量明显高于老年女性和各年龄段男性。,2.,年龄,新生儿血清中,ALP,略高于成人,CK,在出生后,24h,内可达成人的,3,倍，,112,岁内保持较稳定的水平，青春期再增高，以后逐渐降低，直至,20,岁后趋向恒定。,3.,进食,血清中大多数酶不受进食的影响。但高脂、高糖饮食后血清,ALP,活性升高。而酗酒可使血清,-GT,升高，禁食数天可导致血清,AMY,下降。,4.,运动,激烈的肌肉运动可使血清中多种酶活性升高；长时间剧烈运动，血清酶活性升高幅度最大；短时间剧烈运动后，血清,AST,升高出现的时间最早，当运动停止后，酶活性逐渐下降，其中,ALD,和,CK,恢复最快，,AST,和,LD,次之，而,ALT,最慢 。,5.,妊娠,妊娠时随着胎盘的形成和长大，胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热,ALP,、,LD,、,LAP,和,ALT,（少数）等，引起血清中这些酶升高。,6.,其他,血清中有些酶与同工酶有种族差异，此外，一些酶活性还与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变化及家庭因素等有关。,（三）血清酶的临床应用,部分疾病时血清酶水平的改变,血清酶,酶水平的改变,病毒性肝炎,胆管,阻塞,肌营养障碍,急性心肌梗死,急性胰腺炎,肿瘤转移到,其他,肝,骨,胆碱酯酶,-,或,-,-,-,-,有机磷化合物中毒,丙氨酸转氨酶,-,或,-,或,-,-,天冬氨酸转氨酶,-,-,碱性磷酸酶,-,-,-,骨疾病，骨折,酸性磷酸酶,-,-,-,-,-,-,-,或,前列腺癌,乳酸脱氢酶,-,-,或,巨成红细胞性贫血,肌酸激酶,-,-,-,-,-,脂酶,-,-,-,-,-,-,小肠穿孔,淀粉酶,-,-,-,-,-,-,-,谷氨酰转移酶,-,-,-,-,：酶活性增高；,：酶活性降低；,-,：酶活性无变化,正常尿液中含酶量极少，当肾脏疾病、泌尿道疾病时不同分子量的酶蛋白滤过肾小球或从肾小管、泌尿道上皮细胞分泌。目前对尿液中了解较多的酶约有,40,余种，如,AMS,、,N-,乙酰,-,-D-,氨基葡萄糖苷酶（,N-acetyl-,-D-glucosaminidase,NAG,）、白细胞酯酶,(leucocyte esterase),、溶菌酶（,lysozyme,LZM,）、丙氨酸氨基肽酶（,alanine aminopeptidase,AAP,）、,-,葡萄糖苷酸酶,(,glucuronidase,GRS),、亮氨酸氨基肽酶（,leucine aminopeptidase,LAP,）、,LD,、,ALP,、,-GT,等。,1.,AMS,主要由唾液腺或胰腺分泌，有,S-,型（唾液腺型）和,P-,型（胰腺型）两种同工酶，,P-,型同工酶在尿中比例较高。急性胰腺炎、急性腮腺炎时血、尿,AMS,活性均升高。,尿液淀粉酶在临床应用时应注意以下事项：,用于诊断急性胰腺炎时，应排除肾病和巨淀粉酶血症；,考虑尿液淀粉酶活性影响因素；,急性阑尾炎、肠梗阻、胰腺癌、胆石症、肠梗阻或溃疡时，亦可使,AMS,结果升高。,二、尿液酶,2.,NAG,主要来自肾近曲小管上皮细胞，分子量约,130-140kd,，尿,NAG,活性升高，除可能有前列腺炎和精液混入原因外，是各种肾实质早期损伤的敏感标志物，也是糖尿病肾病早期发现和病程监测的重要项目。,另外，尿,NAG,升高直接反映肾病综合征、肾小球肾炎、高血压肾病以及狼疮性肾炎的发生和发展，并有重要的随访意义。,尿,NAG,及其同工酶对肾盂肾炎、上下输尿管等尿路感染反应灵敏，对治疗药物的毒性反应强烈，并在肾脏重金属毒害、肾移植排异监测等方面具有重要意义。,3.,白细胞酯酶,细胞质含嗜苯胺蓝颗粒的细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞均含有白细胞酯酶。尿白细胞酯酶活性升高（或定性试验阳性）提示尿路炎症。,三、浆膜腔积液酶,人体胸腔、腹腔和心包腔、关节腔统称为浆膜腔（,serous cavity,），病理情况下浆膜腔内有大量液体潴留而形成浆膜腔积液（,serous effusion,）,积液因部位不同可分为胸腔积液、腹腔积液、心包腔积液、关节腔积液，根据产生的原因和性质又可分为漏出液和渗出液。,已发现浆膜腔积液中酶有数十种之多，较有临床意义的有,LD,、,ADA,、,LZM,、,AMS,、,ALP,、血管紧张素转化酶,-,（,angiotensin-Icoverting enzyme,ACE,）等。浆膜腔积液中的酶学检查有助于鉴别积液来源，并对疾病诊断和治疗监测具有重要意义。,四、脑脊液酶,正常人由于血脑屏障完整，脑脊液内酶浓度比血清内酶浓度低；当颅脑损伤，颅内肿瘤或脑缺氧时，血脑屏障破坏，细胞膜通透性也有改变，使脑脊液内酶量增加，且不受蛋白总量、糖含量及细胞数的影响；主要与脑细胞坏死程度和细胞膜的损害程度有关。临床上常用的有神经原特异性烯醇化酶,(neuron specific enolase,NSE),、溶菌酶、,ADA,、,CK,及脑型同工酶,(CK-BB),、,LD,及其同工酶、,ALT,、,AST,、谷氨酸脱羧酶,(GAD),、,1,-,抗胰蛋白酶（,1,-AT,）、磷酸已糖异构酶,(PHI),等。,（一）,CSF-ALT,、,CSF-AST,正常脑脊液,ALT,、,AST,活性约为血清酶活性的二分之一，,CSF-ALT,、,CSF-AST,升高常见于脑梗塞、脑萎缩、急性颅脑损伤、中毒性脑病及中枢神经系统转移癌等。,（二）,CSF-LD,及其同工酶,正常,CSF-LD,约为血清酶活性的,1/10,，新生儿略高，,CSF-LD,升高常见于细菌性脑膜炎、脑血管病、脑瘤及脱髓鞘病等有脑组织坏死时。,脑梗死、脑出血或蛛网膜下腔出血的急性期患者,CSF-LD,明显升高。,CSF-LD,同工酶还可作为急性缺血性脑血管病患者疗效和病情判断的指标。,癌性脑膜炎和大脑转移瘤患者,CSF,的,LD,1,/LD,2,平均比值小于,1,，而原发性良性或恶性肿瘤患者以及癫痫、病毒性脑膜炎、椎间盘突出等该平均值小于,1,。,（三）,CSF-NSE,（神经原特异性烯醇化酶）,烯醇化酶是细胞代谢过程中参与糖酵解过程的关键酶，由,、,、,3,种亚基组成,、,、,、,、,5,种同工酶，其中,型烯醇化酶被称为神经元特异性烯醇化酶，定位于脑灰质神经细胞和末梢神经元。正常情况下，,CSF,中,NSE,含量极低，当神经元受损以及血,-,脑脊液屏障破坏，存在于神经元和神经内分泌细胞中的,NSE,被释放入脑脊液。,CSF-NSE,可用于诊断急性脑血管病病灶大小、脑损伤程度及预后。,CSF-NSE,是癫痫持续状态（,SE,）后脑损伤的敏感指标，癫痫发作,60min CSF-NSE,升高到基础值的,3-4,倍，而此时血清,NSE,变化不明显。,（四）,CSF-ADA,临床上多采用自动化仪器酶法连续监测法测定。,ADA,来自,T,淋巴细胞，结核性脑膜炎患者脑脊液中,ADA,增高程度明显高于其他性质的脑脊液，且其阳性率可达,80%,90%,，因此测定脑脊液中,ADA,可用于结核的诊断及鉴别诊断。,（五）,CSF-LZM,（脑脊液溶菌酶）,常用平板法、比浊法及电泳法检测。脑脊液溶菌酶升高常见于细菌性脑膜炎，且其升高与蛋白、糖、白细胞尤其中性粒细胞关系密切，特别是在结核性脑膜炎中增高更为明显，且随病情变化而增减。因此测定脑脊液中溶菌酶含量可用于结核性脑膜炎的鉴别诊断及预后判断。,（六）,CSF-CK,、,CSF-CK-CK-BB,正常脑脊液,CK,活性低于血清，升高常见于化脓性脑膜炎、结核性脑膜炎、进行性脑积水、继发性癫痫、多发性硬化症、蛛网膜下腔出血、慢性硬膜下水肿、脑供血不足及脑肿瘤等，化脓性脑膜炎尤为明显。,（七）,CSF-,1,-AT,1,-AT,是一种急性炎症反应性糖蛋白，正常人,CSF-,1,-AT,活性较低，不易测出，当,CNS,病变时，,CSF-,1,-AT,可增高，以化脓性脑膜炎时增高最为显著，其次为结核性脑膜炎。,CSF-,1,-AT,可作为中枢神经系统鉴别及血脑屏障完整性的诊断指标之一。,疾病诊断学中脑脊液酶学指标的选择,疾病名称,脑脊液酶,细菌性与病毒性脑膜炎的鉴别,LD,及其同工酶,PHI,1,-AT,结核性脑膜炎,临床诊断中风范围、程度及预后,NSE,CK,CK-BB,缺氧性脑损伤、脑外伤,NSE,CK,CK-BB,Greutzfeldt-Jakob,病,NSE,痴呆的鉴别,AST,NSE,癫痫,NSE,GAD,原发性或继发性脑恶性肿瘤,NSE,LD,及其同工酶,五、同工酶的诊断价值,临床诊断常用的同工酶有,LD,同工酶、,CK,同工酶、,ALP,同工酶、,ACP,同工酶、,AST,同工酶、糖原磷酸化酶（,GP,）同工酶、芳香基硫酸酯酶（,ARS,）同工酶、醛缩酶（,ALD,）同工酶、,-,谷氨酰转肽酶（,-GT,）同工酶、谷胱甘肽,S,转移酶（,GST,）同工酶、淀粉酶（,AMS,）同工酶等，它们在心肌梗死、肝功能损伤、恶性肿瘤、肌肉疾病和神经系统疾病的诊断及鉴别诊断中起着重要的作用。,六、病例分析,病例,1,【,病史,】,患者，男，,53,岁，因心悸胸闷,7,天入院。活动后气短，并有下肢水肿。体格检查：体温，脉搏,110,次,/,分，呼吸频率,28,次,/,分，血压,100/60mmHg,，急性痛苦病容。,【,实验室检查,】CK-MB 160U/L,，心电图示,、,、,VF,导联出现坏死性,Q,波、,ST,段呈弓背向上抬高，肌钙蛋白，,NT-proBNP1620pg/ml,。,【,临床诊断,】,急性心肌梗死。,【,诊断依据,】,心肌酶、肌钙蛋白结果提示急性心肌梗死，心电图结果也支持；,NT-proBNP,结果反映出患者由于心肌梗死，表现出心力衰竭。,病例,2,【,病史,】,某男性患者，于,2,小时前搬重物时突然感到胸骨后出现压榨性疼痛，休息与口含硝酸甘油均不能缓解，伴大汗、恶心，呕吐过,2,次，为胃内容物，大小便正常，既往无高血压和心绞痛病史，无药物过敏史。体格检查：基本体征正常，急性痛苦病容，平卧位，无皮疹和发绀，浅表淋巴结未触及，巩膜不黄，颈软，颈静脉无怒张，心界不大，有期前收缩,56,次,/,分，心尖部有,S,4,，肺清无啰音，下肢不肿。心电图示：,STV1-5,升高，,QRSV15,呈,Qr,型，,T,波倒置和室性期前收缩。,【,实验室检查,】,Mb:80,g/L,，,CK-MB mass:10,g/L,，,g/L,；行溶栓治疗后，,Mb:323,g/L,，,CK-MB mass:69,g/L,，,g/L,。,【,临床诊断,】,急性前壁心肌梗死，行溶栓治疗有效。,【,诊断依据,】,根据症状和心电图结果可主要诊断为急性前壁心肌梗死。考虑溶栓治疗，根据溶栓治疗标准：胸疼发作时间在,6,小时内；年龄,24,g/L(L.h),或增加,4,倍以上；,cTnI,或,cTnT,：增加比率,g/L(L.h),或增加倍以上，可判断治疗心肌梗死溶栓治疗后心肌标志物升高。,病例,3,【,病史,】,某成年女性，黄疸并有恶心表现，尤其是进食脂肪餐后，常有腹胀和不适。排泄恶臭而淡色的粪便和深褐色尿液。无既往病史，其男友为乙肝病毒携带者。体格检查：患者有黄疸，肝大，有触痛，中等度腹水。,【,实验室检查,】,血浆,Tbil:625,mol/L,，,ALP:222U/L,，,AST:1837U/L,，秒，秒。尿液：,Bil(+),，,Uro:(+),。,【,临床诊断,】,急性传染性乙型肝炎。,【,诊断依据,】,血浆,AST,活性和胆红素浓度明显增加，,ALP,活性则为轻度增加，提示肝细胞功能不良继发中度胆汁淤积。总蛋白水平降低主要是由于肝脏合成蛋白质减少，使白蛋白浓度降低所致。凝血时间延长与肝脏合成凝血因子减少有关。尿中出现胆红素表明存在高结合胆红素血症。尿胆原水平增加与肝功能低下有关。,病例,4,【,病史,】,某老年女性，,2,周前出现皮肤黄染、瘙痒，伴食欲低下、乏力，小便黄。有胆囊结石,15,年，胆囊炎,2,年。体格检查：全身皮肤、巩膜黄染，皮肤瘙痒。,B,超检查发现胆总管结石，胆囊萎缩。,【,实验室检查,】,血浆,Tbil,：,625,mol/L,，,TP,：，,Alb,：，,ALT,：,126U/L,，,AST,：,98U/L,，,ALP,：,873U/L,，,GGT,：,457U/L,。尿液,Bil,：,(+),，,Uro,：,(-),。,【,临床诊断,】,肝后性黄疸。,【,诊断依据,】,该患者有明显黄疸。实验室检查结果发现：该患者总蛋白和白蛋白水平正常，,ALT,和,AST,轻度升高，,ALP,和,GGT,异常升高；尿液分析发现尿胆红素明显升高；,B,超检查发现胆囊结石。,病例,5,【,病史,】,患者，女，,54,岁，自述有上呼吸道感染症状，后出现咳嗽、咳痰，呈阵发性加重，咳黄色脓痰，胸闷憋喘并于活动后加重，伴恶心，痰中带血丝。体格检查：双侧颈部可触及肿大淋巴结，双肺呼吸音粗，心率,100,次,/,分，心音低钝、遥远，腹平软，无压痛。行胸部,CT,示：心包积液，,B,超检查示心包积液量约,250ml,。行心包积液抽液术，抽出约,170ml,积液，为酱油色血性液体。,【,实验室检查,】,白细胞：,6000X10,6,/L,，中性粒细胞,1500 X10,6,/L,，总蛋白,45g/L,；积液蛋白,/,血清蛋白比值为，葡萄糖，,LD 4200U/L,，有核细胞分类,75%,为淋巴细胞。,【,临床诊断,】,积液由肺癌引起。,【,诊断依据,】,心包积液实验室检查结果提示：心包积液为渗出液。进一步检查：患者行胸部,CT,检查（及肺部活检病理）示：右肺癌，双侧颈部可触及肿大淋巴结，无压痛。（显微镜细胞学检查发现癌细胞）。,病例,6,【,病史,】,某男，,60,岁，上腹剧烈疼痛,1,天，向腰背部放射，伴恶心呕吐，腹胀。发热，体温。体格检查：上腹部压痛（,+,），反跳痛（,+,），肌紧张（,+,），墨菲氏（,+,），肝区叩痛（,+,）。肠鸣音明显减弱。,1,天后右下腹有压痛，反跳痛及肌紧张。,B,超示：胆石症，胰腺水肿，周围有渗出，腹腔少量积液。,【,实验室检查,】,血尿淀粉酶均明显升高。,【,临床诊断,】,急性胰腺炎并腹膜炎。,【,诊断依据,】,上腹剧痛,1,天，向腰背放射；胃肠道症状；压痛并反跳痛；墨菲氏（,+,）；血尿淀粉酶明显升高；,B,超示：胆石症，胰腺水肿，周围有渗出。,病例,7,【,病史,】,一般资料：中年男性，因乏力、腹胀伴皮肤巩膜黄染,1,月入院，,B,超示肝脾大，中度腹水。,20,年前患急性肝炎。,【,实验室检查,】,血细胞分析三系轻度降低，肝功能检查示双相性黄疸、白蛋白低、,ALT,及,AST,明显升高、乙肝两对半检查为大三阳，,PT,、,APTT,、,TT,均延长，,FIB,减低。进一步检查：,F,：,C,正常，,D,二聚体轻度增加。,【,临床诊断,】,肝脏病性凝血功能障碍。,【,诊断依据,】,该患者有明确的肝炎史，肝功能明显异常，血细胞分析三系轻度减低，符合脾功能亢进；,PT,、,APTT,、,TT,延长和,FIB,减低均是由于肝脏合成凝血因子障碍所致，但由于,F,不在肝脏合成，其活性可正常，同时,F,：,C,正常，,D,二聚体轻度增加不支持,DIC,。,病例,8,【,病史,】,患者，男性，,46,岁，农民，因头晕,6,个月、持续性头痛,1,个月入院。两年前经胃镜检查和病理诊断为胃腺癌。做胃大部切除术后，每年定时放疗。,2,个月前复查，残余胃部未见癌变，肝、肾、肺,CT,检查未见异常。，颅内,MRI,检测显示脑膜周围模糊，未见占位性病变。,【,实验室检查,】,血清,g/L),，,CSF,检测未见恶性肿瘤细胞，,g/L),，,CSF-LD,1,/LD,2,比值为。,【,临床诊断,】,胃癌脑转移。,【,诊断依据,】,患者有胃腺癌病史，并且出现头痛、头晕症状，考虑肿瘤脑转移可能，但脑脊液细胞学检测未见肿瘤细胞，但脑脊液,CEA,检测结果升高，且脑脊液,LDH,1,/LDH,2,比值为（肿瘤脑转移及原发性脑肿瘤平均比值小于,1,，但后者远低于前者），结合,MRI,结果提示脑转移肿瘤。,谢谢！,