原位杂交技术原理及其应用[共58页]

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,原位杂交技术,in situ hybridization,1,核酸分子杂交技术,在研究,DNA,分子复制,原理的基础上发展起来的一种技术。两条核苷酸单链片段，通过氢键结合，形成,DNA-DNA,、,DNA-RNA,或,RNA-RNA,双链分子,按其作用方式可大致分为两种：固相杂交和液相杂交,液相杂交,是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等,2,固相杂交,是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交包括：,菌落原位杂交（,colony in situ hybridization,）、,斑点杂交（,Dot blot,）、,Southern,印迹杂交（,Southern blot,）,Northern,印迹杂交（,Northern blot,）,组织原位杂交（,Tissue in situ hybridization,），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术,3,原位杂交技术的基本原理,利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。,1.,两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成,DNA-DNA,、,DNA-RNA,或,RNA-RNA,双键分子,2.,应用带有标记的（有放射性同位素，如,3H,、,35S,、,32P,，荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质,)DNA,或,RNA,片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸,(RNA,或,DNA,）片段进行杂交,3.,用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的,mRNA,或,DNA,的存在与定位,4,5,用原位杂交术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。,此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。,6,Aromase gene,The rat brain section,In situ hybridization,7,培养细胞,8,原位杂交组织化学技术发展,1961,年，,Hall,液相核酸杂交技术,1969,年，,Gall,和,Pardue,用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。,1969,年，,Buongiorno-Nardelli,和,Amaldi John,利用,同位素标记核酸探针,进行了细胞或组织的基因定位，创造了原位杂交细胞或组织化学技术。,Orth,（,1970,）应用,3,H,标记,的兔乳头状瘤病毒,cRNA,探针,与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒,DNA,在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。,9,由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。,Bauman,（,1981,）等首先应用,荧光素标记,cRNA,探针,做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。,Shroyer,（,1982,）报道用,2,，,4,二硝基苯甲醛,（,DNP,）标记,DNA,探针,，使该,DNA,探针具有抗原性，然后用兔抗,DNP,的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。,这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。,10,Pezzella,（,1987,）创建了用,磺基化,DNA,探针,来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使,DNA,探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。,本法的优点是磺基化,DAN,探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。,生物素标记探针技术,是,Brigat,（,1983,）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒,DNA,，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶,-,抗过氧化物酶显示系统显示病毒,DNA,在细胞中的定位。,生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。,11,上述生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫,光促生物素标记核酸技术,（,1985,） ，该技术是用光敏生物素（,Photobiotin,）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。,光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每,100,150,个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度。,12,近年来，,地高辛,（,Digoxigonin,）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。,Boeringer Mannhem Bio,chemisca,于,1987,年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。,和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组,DNA,中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶,-,抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。,13,核酸探针的分类,核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。,根据探针的核酸性质不同可分为,DNA,探针、,RNA,探针、,cDNA,探针、,cRNA,探针和寡核苷酸探针等。,DNA,探针还有单链,DNA,（,Single stranded, ssDNA,）和双链,DNA,（,Double stranded, dsDNA,）之分。,14,早期应用的主要是,DNA,探针,Temin,在,70,年代研究致癌,RNA,病毒时制备了,cDNA,探针,（,complementary DNA,），其基本原理是以,RNA,为模板，经逆转录酶（,reverse transcriptase,）又称为,RNA,指导的,DNA,聚合酶催化产生的。该酶以,RNA,为模板，按照,RNA,的核苷酸顺序合成,DNA,，这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故称逆转录。,cDNA,是指互补于,mRNA,的,DNA,分子。,15,RNA,探针,是将特异性的,cDNA,片段插入含有,RNA,聚合酶启动子的转录性载体。,这类载体包括,pSP64,和,pSP65,，它们具有不同的,启动子,在多克隆位点的各侧。,Psp64,和,pSP65,在,sP6,启动子的多克隆位点的方向是不同的。通过改变外源基因的插入方向或选用不同的,RNA,聚合酶，可以控制,RNA,的转录方向，即以哪条,DNA,链为模反转录,RNA,。从而可以得到与,mRNA,同序列的同义,RNA,探针（,Sense probe,）和与,mRNA,互补的反义,RNA,探针（,antisense probe,），又称互补,RNA,探针（,complementary RNA probe , cRNA,）。,通常用同义,RNA,探针做为反义,RNA,探针的阴性对照。,由于,RNA,探针是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应极高。有报告认为其杂交率高于,DNA,探针的,8,倍。,16,DNA,合成仪的诞生使制造,寡核苷酸探针,成为可能，与上述探针不同的是寡核苷酸探针不是克隆性,DNA,探针，它是由,DNA,合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，价格低廉的优点，也可进行放射性与非放射性标记，但其特异性不如克隆性探针强，亦不如其杂交信号高。,17,原位杂交组织化学技术的基本步骤,大致可分为：,杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等；,杂交；,杂交后处理；,显示（,visualization,）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。,18,（一）固定,兼顾三个方面：,保持细胞结构，,最大限度地保持细胞内,DNA,或,RNA,的水平；,使探针易于进入细胞或组织。,DNA,是比较稳定的，,mRNA,却绝然不同，非常容易被降解。因此，对于,DNA,的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，在,RNA,的定位上，如果要使,RNA,的降解减少到最低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释,ISHH,的结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对,RNA,保存所带来的影响，因组织中,mRNA,的降解是很快的。,19,在固定剂中，最常用的是,多聚甲醛,。,对于,mRNA,的定位，我们常采用的方法是将组织固定于,4%,多聚甲醛磷酸缓冲液中,1,2h,，在冷冻前浸入,15%,蔗糖溶液中，置,4,冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。,组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入,4%,多聚甲醛约,10min,，空气干燥后保存在,-70,。如冰箱温度恒定，在,-70,可保存数月之久不会影响杂交结果。,在病理学活检取材多用福尔马林固定和石蜡包埋，这种标本对检测,DNA,和,mRNA,有时也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低,mRNA,的含量。,20,（二）玻片和组织切片的处理,1,玻片的处理玻片包括盖片和载片,应用热肥皂刷洗，自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡,24h,，清水洗净烘干，,95%,酒精中浸泡,24h,后蒸馏水冲洗、烘干，烘箱温度最好在,150,或以上过夜,以去除任何,RNA,酶。盖玻片在有条件时最好用,硅化,处理，锡箔纸包裹无尘存放。,由于,ISHH,的实验周期长，实验程序繁杂，因此，要应用,粘附剂,预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。,21,常用的粘附剂有,铬矾,-,明胶,液，其优点是价廉易得，但在长周期实验过程中，粘附效果不够理想。,多聚赖氨酸,液具有较好的粘附效果，但价格昂贵，需进口。,近年,Vector Lab (U.S.A.),推出一种新的粘附剂叫,Vectorband Reagent,每一单位包装可制备,500,700,张载玻片，粘附效果极佳，价格较多聚赖氨酸便宜，制片后可长期保存应用。,22,2,增强组织的通透性和核酸探针的,穿透性,此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、切片的厚度和核酸探针的长度而定。,增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂（,detergent,）或称清洗剂,Triton X-100,、酒精或某些,消化酶,如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（,diastase,）等。,这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低,RNA,的保存和影响组织结构的形态，因此，在用量及孵育时间上应慎为掌握。,23,蛋白酶,K,（,Proteinase K,）,:1g/ml(,于,0.1mol/l Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0,缓冲液中,),37,孵育,15,20min,，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。,蛋白酶,K,还具有消化包围着靶,DNA,的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。,在蛋白酶,K,消化后，应用,0.1mol/L,的,甘氨酸,溶液（在,PBS,中）清洗以终止蛋白酶,K,的消化作用，甘氨酸是蛋白酶,K,的抑制剂。为保持组织结构，通常用,4%,多聚甲醛再固定。,Burns,等（,1987,）报告应用,胃蛋白酶,（,Pepsin,）,20,100g/ml,（用,0.1n HCl,配）,37,、,30min,进行消化，所获实验结果优于蛋白酶,K,。,24,多聚甲醛固定后，浸入,乙酸酐,（,acetic anhydride,）和,三乙醇胺,（,tri,ethanolamine,）中以减低静电效应，减少探针对组织的非特异性背景染色。,有的作者除在室温下浸于上述溶液,10min,外，还在预热,37,的,50%,甲酰胺,/2SSC,液,中预杂交,15min,，然后用,2SSC,，,0.30mol/l NaAc/0.030mol/L,枸橼酸钠液中浸,15min,。,但也有报道乙酸酐和三乙醇胺液的处理并不能起到减低背景的目的，不能改善,ISHH,的信,/,噪比例。,25,3,减低背景染色,杂交后（,Posthybridization,）的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。,预杂交（,Prehybridization,）是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（,Dextran sulphate,）。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。,26,4,防止,RNA,酶的,污染,由于在手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有,RNA,酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（,240,）烘烤以达到消除,RNA,酶的目的。,要破坏,RNA,酶，其最低温度必须在,150,左右。杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。,27,（三）杂交,（,Hybridisation,）,杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片。加盖片的目的是防止孵育过程中的高温（,50,左右）导致杂交液的蒸发。硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质，光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触，盖玻片自身有一定重量能与有限的杂交液吸附达到覆盖和防止蒸发的作用。为保证杂交所需的湿润环境，放在湿盒中进行孵育。,28,注意事项,1,探针的浓度,很难事先确定，但要掌握一个原则，即探针浓度必须给予该实验最大的信,/,噪比值。,非放射性标记（生物素或地高辛）探针浓度为,0.5,5.0g/ml,（即,0.5,5.0ng/l,）。放射性标记的,dsDNA,或,cRNA,探针浓度在,2,5ng/l,。,必须强调的是，加杂交液的量要适当，以,10,20l/,每张切片为宜。杂交液过多不仅造成浪费，而且液量过多常易致盖玻片滑动脱落，影响杂交效果，过量的杂交液含核酸探针浓度过高，反易导致高背景染色等不良后果。,29,2,探针的长度,一般应用于,ISHH,探针的最佳长度应在,50,100,个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。,30,3,杂交的,温度和时间,原位杂交中，多数,DNA,探针需要的,Tm,是,90,，而,RNA,则需要,95,。,在杂交的程序中常规的加入,30%,50%,甲酰胺（,for,mamide,）于杂交液中。反应液中每增加,1%,的甲酰胺浓度，,Tm,值可降低,0.72,。,可用调节盐浓度的办法来调节,Tm,。,由于盐和甲酰胺浓度的调节等因素，实际采用的原位杂交的温度在,Tm-25,左右，即比,Tm,减低,25,，大约在,30,60,之间,根据探针的种类不同，温度略有差异，,RNA,和,cRNA,探针一般在,37,42,左右，而,DNA,探针或细胞内靶核苷酸为,DNA,的，则必须在,80,95,加热使其变性，时间,5,15min,，然后在冰上搁置,1min,，使之迅速冷却，以防复性，再置入盛有,2SSC,的温盒内，在,37,42,孵育杂交过夜。,31,从理论上讲，核苷酸杂交的有效反应时间在,3h,左右。但为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为,16,20h,。当然，杂交反应的时间与核酸探针长度与组织通透性有关。,有作者主张杂交反应的孵育应在黑暗环境中进行，因为光线会促进甲酰胺的电离作用。,32,4,杂交严格度（,Hybridization stringency,）,杂交条件的严格度（,stringency,）表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。错配对,(mismatch,）杂交的稳定性较完全配对杂交体差，因此，通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。,杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低。一般来说，,低严格度,（,low stringency,）杂交及冲洗条件在,Tm -35,至,Tm 40,之间，高盐或低甲酰胺浓度。在这种条件下，大约有,70%,90%,的同源性核苷酸序列被结合，其结果是导致非特异性杂交信号的产生。,中严格度,，,Tm -20,至,Tm-30,的范围。,高严格度,（,high stringency,）为,Tm-10,至,Tm-15,，低盐和高甲酰胺浓度。在这种条件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。,33,由于原位杂交技术多数是在,Tm-25,进行的，不属于高严格范围，无疑会产生非特异性结合导致信,/,噪比减低。在这种情况下，可用加强杂交后处理洗涤的严格度使非特异性的杂交体减少。由于,RNA,杂交的稳定性，应用,cRNA,探针进行细胞或组织的原位杂交时的杂交温度比其它核酸探针要高,10,15,。实验证明，,cRNA,产生的信号比双链,cDNA,要强。单链的,RNA,探针其杂交信号大于双链的,cDNA,的约,8,倍。,34,5,硫酸葡聚糖（,Dextran sulphate,）和甲酰胺（,formamide,）,硫酸葡聚糖是核酸杂交液中仅次于甲酰胺的一种组成成份。在杂交液中，甲酰胺占,50%,左右，而硫酸葡聚糖占,10%,左右。它具有极强的水合（,hydrate,）作用，能大大增加杂交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促进杂交率，特别是对双链核酸探针。这是应用硫酸葡聚糖于杂交液中的主要目的。,甲酰胺的主要作用在调节杂交反应温度方面，从而有助于保持组织的形态结构。甲酰胺还可防止在低温时非同源性片段的结合，但甲酰胺具有破坏氢键的作用从而具有一种不稳定的作用。,35,（四）杂交后处理（,post hybridisation treatment,）,杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。,通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。,在杂交后漂洗中的,RNA,酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对,RNA,除去。,洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。,必须注意的是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥。,36,（五）显示（,Visualization,）,显示又可称为检测系统（,Detection system,）。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。,细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射自显影可利用人工或计算机辅助的图象分析检测仪（,computer assisted image analysis,）检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用显微分光光度计或图像分析仪对不同类型和数量的核酸的显色强度进行检测。,37,（六）对照实验和,ISHH,结果的判断,和其它实验方法一样，并非,ISHH,的任何阳性信号都是特异性的，故必须同时有对照试验以证明其特异性。对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定，常用的对照试验有下列几种,38,ISHH,对照试验一览表,核乳胶或非放射性检测系统对照试验,Northern,或,Southern,印迹杂交法,ISHH,与免疫细胞化学结合,应用多种不同的核苷酸探针与同一靶核酸进行杂交,将,cDNA,或,cRNA,探针进行预杂交（吸收试验）,与非特异性（载体）序列和不相关探针杂交（置换试验）,将切片应用,RNA,酶或,DNA,酶进行预处理后杂交,应用同义,RNA,探针（,Sense probe,）进行杂交,以不加核酸探针杂交液进行杂交（空白试验）,组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行,ISHH,对照,应用未标记探针做,ISHH,，进行对照,39,从理论上讲，对照试验设置愈多其靶核苷酸特异性确定愈可靠，但现实是不可能的。因此，在上述对照试验中应任选设至少,3,4,种用以证实,ISHH,结果的可靠性。,比较可靠的对照试验,:,Northern,和,Southern,印迹杂交法。,用结合的免疫组织化学和,ISHH,法从蛋白质（或多肽）水平和转录水平在相邻切片或同一切片中证明同一种多肽和相应,mRNA,共存于同一细胞中。,预先将切片用,DNA,酶或,RNA,酶消化，然后用,ISHH,技术证明丢失的是,DNA,或,RNA,。,如同免疫组化的吸收试验一样，事先与特异性的,cRNA,或,cDNA,进行杂交。再进行,ISHH,，其结果应为阴性。,由于同义,RNA,探针和组织内,mRNA,序列顺序是相同的，应用其进行,ISHH,，结果应为阴性。,检测系统的对照如乳胶或酶显色系统也应在无标记探针的情况下进行。,40,ISHH,的最大优点是它的高度特异性，它可测定组织、培养的单个细胞或细胞提取物中的核苷酸含量。,应用高敏感度的放射性标记,cRNA,探针在理想的,ISHH,的实验条件下检测,mRNA,，其敏感度可达到,20,个,mRNA,拷贝,/,每个细胞。,由于双链,DNA,的稳定性，在用,ISHH,定位,DNA,时很少发生丢失，降解。在靶核苷酸序列比较伸展的情况如染色体铺片，长于,2kb,的探针可以应用。因此，其敏感性高到能够出在染色体铺片上，有时甚至在组织切片上的单个基因拷贝。,正因为如此，对,ISHH,结果的解释应持慎重态度，特别是前人未报告过的新发现。,因为如前所述，影响,ISHH,实验结果的因素太多，比如在外科或实验取材后未及时的固定或冷冻可由于组织中,mRNA,的降解而导致假阴性结果。,另外，在各种类型核酸探针进入细胞、组织和各种器官的能力，又叫可接近性（,acessiblity,）各异。这些诸多因素都将影响,ISHH,的实验结果。,41,1,、使用,地高辛,标记的,核酸探针,进行,石蜡切片,的,RNA,原位杂交,第一天,1,） 二甲苯于,37,脱蜡,2,次，每次,15,分钟；,2,） 无水乙醇浸泡,2,次，每次,3,分钟；,3,）,95%,乙醇浸泡,2,次，每次,3,分钟；,4,）,PBS,清洗,3,分钟；,5,）,2%,焦碳酸二乙酯室温下浸泡,10,分钟；,6,）,PBS,清洗,10,分钟；,7,） 加入胃蛋白酶,25ul/ml,，,37,孵育,15,分钟；,8,）,PBS,清洗,2,次，每次,3,分钟；,9,）,0.2N,的,HCl,孵育,30,分钟；,10,）,PBS,清洗,2,次，每次,3,分钟；,11,）,0.25%,无水乙酸和,0.1M,三乙醇胺孵育,10,分钟；,12,）,PBS,清洗,2,次，每次,5,分钟；,13,）预杂交缓冲液孵育,30,分钟；,14,）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，,85,加热,5,分钟，置于冰块中,10,分钟；,原位杂交操作,流程,42,15,）杂交；第二天,16,）将玻片置于,SSC,中,2,次，每次,5,分钟以去除封片；,17,）,PBS,清洗,3,分钟；,18,）,RNA,酶溶液中（或,0.1-1ng/mlPBS,中），,37,孵育,30,分钟；,19,）,PBS,清洗,5,分钟；,20,）室温，,2SSC,清洗,10,分钟；,21,）,37,，,1SSC,清洗,10,分钟；,22,）,37,，,0.5SSC,清洗,10,分钟；,23,）缓冲液孵育,10,分钟；,24,）缓冲液（,1%,正常绵羊血清和,0.03%Triton X-100,）孵育,30,分钟；,25,）加入抗地高辛抗体，,37,孵育,3,小时；,26,）缓冲液清洗,2,次，每次,10,分钟；,27,）缓冲液清洗,2,次，每次,5,分钟；,28,）制成,NBT/BCIP,暗处保存,30-60,分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到,16,小时；,29,）停止缓冲液的反应，用水进行简单的清洗；,30,）固红，脱水以及封片进行核的复染。,43,2,、使用,地高辛,标记的,寡核苷酸探针,进行,石蜡切片,的,原位,DNA,杂交,第一天,1,） 二甲苯于,37,脱蜡,2,次，每次,15,分钟；,2,） 无水乙醇浸泡,2,次，每次,5,分钟；,3,）,95%,乙醇浸泡,2,次，每次,5,分钟；,4,）,PBS,清洗,5,分钟；,5,）,2%,焦碳酸二乙酯室温下浸泡,10,分钟；,6,）,PBS,清洗,5,分钟；,7,） 加入胃蛋白酶,25ul/ml,，,37,孵育,10,分钟；,8,）,PBS,清洗,2,次，每次,5,分钟；,9,）,0.2N,的,HCl,孵育,30,分钟；,10,）,PBS,清洗,2,次，每次,5,分钟；,11,）,0.25%,无水乙酸和,0.1M,三乙醇胺孵育,10,分钟；,12,）,PBS,清洗,5,分钟；,13,）预杂交缓冲液孵育,30,分钟；,14,）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；,44,15,）杂交；第二天,16,）将玻片置于,SSC,中以去除封片；,17,）室温，,2SSC,清洗,10,分钟；,18,）,37,，,1SSC,清洗,10,分钟；,19,）,37,，,0.5SSC,清洗,10,分钟；,20,）缓冲液孵育,10,分钟；,21,）缓冲液孵育,30,分钟；,22,）加入抗地高辛抗体,37,孵育,3,小时；,23,）缓冲液清洗,2,次，每次,5,分钟；,24,）缓冲液清洗,2,次，每次,5,分钟；,25,）制成,NBT/BCIP,暗处保存,30-60,分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到,16,小时；,26,）停止缓冲液的反应，用水进行简单的清洗；,27,）固红，脱水以及封片进行核的复染。,45,成年大鼠海马、齿状回,DAT1mRNA,阳性神经元,大鼠杏仁外侧核,DAT1 mRNA,阳性神经元,46,A,大鼠舌下神经核,(12)DAT1 mRNA,阳性神经元,100,B,大鼠延髓中央网状核,DAT1 mRNA,阳性神经元,200,47,FISH ,F,luorescent,I,n,S,itu,H,ybridization,荧光原位杂交,探针,DNA,加入荧光标记,解螺旋，杂交,48,FISH,16,16,例如左图,:,通过使用painting 探针（针对16号染色体)，可以确认16号染色体的一段易位到了9号染色体。,49,使用,Vysis AneuVysion,探针组对,13, 18, 21, X, Y,染色体进行杂交,普通图像 分类色图像,50,5,号染色体上杂交了7种探针，这些探针在位置上分别有部分重叠。,18 条带,7 条带,原始图像,DAPI,图像,51,实例,:,X,/,Y,着丝点探针,52,单个或多个全染色体（,WCP),探针,探测缺失,探测易位,bcr,/,abl,53,杂交到有爪蟾蜍染色体上的卫星探针,(SAT1),54,Multi- color ISH,TMB - chr. 1,DAB - chr. 15,NF - chr. 7,Courtesy of T. Ried, M. Macville (NIH, NHGRI),多色原位杂交,55,人类频谱染色体组型分析,频谱,FISH,多色原位杂交,56,实习课,实习时间：,共聚焦：,1,月,12,日,2,：,30,共聚焦实习地点：科研楼,10,楼，,57,Thanks,58,