纳米三氧化二铝薄膜对成骨细胞的影响

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,纳米多孔,Al,2,O,3,薄膜对成骨细胞的影响,Osteogenic differentiation of marrow stromal cells cultured on nanoporous alumina surfaces,Published online 6 November 2006 in Wiley InterScience ().,1,文献出处,2,目录,简介,材料和方法,实验结果,结论,3,简介,用于骨科整形的生物材料面临的一个挑战就是设计材料表面能够满足以下两个条件：,允许依赖锚定的成骨细胞的粘附；,提高成骨细胞的分化能力，从而使成熟的成骨细胞群体能够在适当的生物材料表面快速地形成一个界面层。,4,影响骨植入界面的重要相关参数有表面成分，表面能，表面粗糙度和表面形貌。,研究者已经证明将材料表面控制在,微米,或,纳米,范围内可以改变各种类型细胞的分化程度。骨有一系列分等级的结构包括宏观结构，微观结构和纳米结构。因此，材料表面有等级的形貌，类似于骨的分级结构，将诱导不同的生物反应。本文论述纳米级的形貌对成骨细胞功能的影响。通过检测得知碱性磷酸酶,（,ALP,）,的活性和基质产量增多。,5,Klawitter,和,Hulbert,1,使用氧化陶瓷，证明了孔径为,100m,的多孔表面对于合适的骨内生是必须的。,Bobyn,等,2,使用金属植入管，当孔径在,50-400m,之间表现出良好的骨内生性。,研究显示,3,在高密度的氧化金属层上的更小的孔径能允许骨的长入。例如，在外科手术,2-3,周后，,CaP,涂层的多孔植入管和人骨展现出了相同的骨内生性。,在一项研究中，随着纳米氧化铝颗粒从,167nm,降到,24nm,，成骨细胞的粘附增加,50%,。与常见孔径（微米级）的氧化铝相比，细胞的增殖能力，碱性磷酸酶的活性，细胞外基质的产量都有明显的增加。,已做实验,1Klawitter JJ, Hulbert SF. Application of porous ceramics for the attachment of load bearing internal orthopedic applications.J Biomed Mater Symp 1972;2:161229.,2 Bobyn JD, Pilliar RM, Cameron HU, Weatherly GC. The optimum pore size for the fixation of porous-surfaced metal implants by the ingrowth of bone. Clin Orthop Relat Res 1980;150:263270.,3 Lee TM, Wang BC, Yang YC, Chang E. Comparison of plasma-sprayed hydroxyapatite coatings and hydroxyapatite/ tricalcium phosphate composite coatings: In vivo study. J Biomed Mater Res 2001;55:360367.,6,实验材料,作为一个生物可相容的陶瓷，已被广泛地应用于整形外科和牙移植手术。氧化物使铝表面在生物环境中具有惰性，因此它是移植工程应用中的可供选择的一种材料。通过阳极氧化处理控制纳米多孔氧化铝的结构，并维持纳米相材料或微米结构陶瓷不具有的机械特性。,纳米多孔氧化铝 (Al,2,O,3,),骨髓基质细胞在培养过程中可向成骨细胞方向分化，随着培养时间的延长，特别是在某些生长因子的影响下，,90 %,以上的细胞可表现出成骨细胞的特征，由于骨髓基质细胞取材方便、成骨能力较明确，同时来源广泛，因此可以用来评价它们与纳米结构表面的相互作用。,骨髓基质细胞（ MSCs）,7,纳米多孔Al,2,O,3,薄膜的制备,高温退火,除油,电化学抛光,第一步阳极氧化,第二步阳极氧化,清洗,马弗炉，500，4h,丙酮，3min，室温,磷酸和硫酸的混合液 （体积比为3:2）,4%的铬酸和8%的磷酸混合液,99.99%的铝片,（2cm,2cm0.5mm）,草酸，冰浴，,60,，30min,8,图一 电化学抛光装置,（10 15min）,磷酸和硫酸混合液,（8090）,9,图二 铝阳极氧化实验装置,(60 300min),草酸溶液,(0.20.5mol/L),（冰浴）,30 50V,10,图三 纳米多孔氧化铝的扫描电镜图（孔径为79nm）,11,细胞培养的准备,Jackson实验室的C57 BJ 小鼠,处死，取下胫骨和股骨,切除两端干骺端，显露骨髓腔,10mL注射器内吸入改良的MEM培养液冲洗骨髓腔内容物,70m的尼龙过滤器,纳米多孔氧化铝薄膜放在六孔细胞培养板里加上盖子在紫外光下预消毒24小时,薄膜浸在70%的乙醇中消毒30分钟,将密度为15-2510,6,/孔,的骨髓基质细胞和消毒过的纳米多孔薄膜一起放在六孔细胞培养板里,无定形态的氧化铝薄膜作为对照试验,用血细胞计数器计算细胞数量,12,评估方向,1,细胞粘附和增殖,2,细胞生存能力,细胞功能,3,4,5,6,碱性磷酸酶（ALP）活性,细胞外基质,细胞形态,13,骨髓基质细胞的密度为1510,6,细胞,/,孔。在培养一天后，,用胰蛋白酶处理，使细胞分离，,观察细胞的粘附情况，培养四天和七天后观察其增殖能力，用血细胞计数器计数。,细胞粘附和增殖,将粘附在氧化铝薄膜上的细胞用Calcein-AM着色检测细胞内的酯酶活性。 Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜，在活细胞内酯酶的作用下，脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光 ，从而反映,酯酶的活性,。,细胞功能,用四甲基偶氮唑盐(,MTT,)比色法检测其生存能力。其检测原理为活细胞线粒体中的,琥珀酸脱氢酶,能打开四唑环，使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色,结晶,甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。,二甲基亚砜,能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。,细胞生存能力,14,碱性磷酸酶（ALP）活性,(细胞培养三周后检测),在室温下，用混有2%的多聚甲醛的热的PBS溶液冲洗细胞三次,细胞固定好之后，向25mL去离子水中加入25mL碱性缓冲溶液制成碱性磷酸酶作用物溶液充分冲洗,每个细胞培养板孔内加入1mL碱性磷酸酶作用物溶液在37条件下反应30分钟,移去0.5mL的溶液同时加入0.5mL NaOH终止反应,通过测定在410nm处吸光度的变化速率来计算ALP的活性,对硝基苯磷酸二钠+H,2,O,碱性磷酸酶,对硝基苯酚+H,3,PO,4,15,细胞外基质,(细胞培养三周后),钙和磷是骨基质的主要成分，一旦细胞在材料表面开始分化，它们将沉积骨基质。从细胞培养板上取出样品风干，进行XPS分析检测钙和磷的含量。,XPS（X射线光电子能谱）的原理是用X射线去辐射样品，使原子或分子的内层电子或价电子受激发射出来。被光子激发出来的电子称为光电子。可以测量光电子的能量，以光电子的动能为横坐标，相对强度（脉冲/s）为纵坐标可做出光电子能谱图。根据能谱图中光电子谱线强度（光电子峰的面积）反应原子的含量或相对浓度 。,16,细胞形态,在细胞培养三周后，用扫描电镜观察细胞的形态。,细胞固定，脱水,用PBS溶液冲洗2次,在含有3%的戊二醛，0.1M的甲胂酸钠，0.1M的蔗糖的定影剂中浸泡45分钟,用含有0.1M的甲胂酸钠和0.1M的蔗糖的缓冲液冲洗两次，每次5分钟,依次用35%，50%，70%，95%和100%的乙醇脱水细胞各10分钟,用六甲基二硅烷浸泡细胞十分钟，使细胞干燥。然后倒掉六甲基二硅烷，使材料表面风干,30,分钟,将材料表面镀上一层,10nm,的金，扫描电镜电压设置为,10-20kV,17,结果,细胞粘附和增殖,细胞生存能力,细胞功能,碱性磷酸酶活性,细胞外基质,细胞形态,18,图四为用血细胞计数器测得的细胞在纳米多孔氧化铝和无定形态氧化铝表面的粘附（培养1天后）和增殖（培养4天和7天后）能力。结果显示，与无定形态氧化铝相比，纳米多孔氧化铝表面 (n=3，p0.01)的细胞的粘附和增殖能力更强。,细胞粘附和增殖,19,细胞生存能力,图五为 MTT分析,在纳米多孔和无定形态氧化铝表面,细胞（培养1天和4天时）中的,甲瓒的吸光度 。,结果显示细胞在纳米多孔氧化铝（,n=3，,p0.01）表面活细胞数更多，即具有更高的生存能力。,20,细胞的功能,图六为在材料表面的被Calcein-AM着色的活细胞图 (10)。,细胞在无定形态氧化铝表面为球形的，而在纳米氧化铝表面为展开状态。,21,碱性磷酸酶活性,图七为无定形态和纳米多孔氧化铝表面细胞（培养2和3周后）的碱性磷酸酶活性测定，通过测定在410nm处对硝基苯酚吸光度的变化速率来计算ALP 的活性，结果显示培养在纳米多孔氧化铝(,n=3，,p,23,成骨细胞形态（1周后）,图八 扫描电镜图像显示细胞在培养1周后粘附情况，与无定形态氧化铝相比，细胞在纳米多孔氧化铝表面聚集并呈现展开的形态，说明细胞对纳米结构更适应。,Amorphous,Nanoporous,24,成骨细胞形态（2周后）,Amorphous,Nanoporous,图九 细胞(培养2周后)在无定形态和纳米多孔氧化铝表面的扫描电镜图像。细胞在纳米多孔氧化铝表面进行延伸，进入分化阶段，而在无定形态氧化铝表面呈球形。,25,成骨细胞形态（3周后）,Nanoporous,Amorphous,图十 在培养3周后，纳米多孔氧化铝表面增殖的细胞通过储存基质形成网状结构，而在无定形态氧化铝表面无此网状结构。,26,结论,设计一种与成骨细胞有良好反应的材料对于整形外科生物材料研究十分重要。在本文中，使用通过两步阳极氧化法制得的纳米多孔氧化铝薄膜检测其在短期内和长期内与细胞的反应。,细胞培养一周后，与无定形态的氧化铝相比，纳米多孔氧化铝表面有更高的细胞粘附，增殖和生存能力。,细胞培养三周后，在纳米多孔氧化铝表面的细胞有更高的碱性磷酸酶活性，钙和磷的浓度也更高。,因此，这项研究证明使用可控制的纳米结构材料可以大大地改善骨细胞的性能，纳米材料在整形外科移植具有很大的潜力。,27,Thank You !,28,