第五章目的基因与载体连接2

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第五章,目的基因与载体的连接,内容提要,基因重组克隆与亚克隆,基因重组对载体的要求与载体类型,连接前的处理,黏性末端连接,平端连接,人工接头连接,同聚寡核苷酸末端连接,第一节 基因重组克隆与亚克隆,外源基因的获取,载体的选择与构建,外源基因与载体的切割与修饰,外源基因与载体的连接（,DNA,体外重组）,重组,DNA,导入受体细胞,重组体的筛选,目的基因的表达,体外重组就是指目的基因与载体,DNA,的连接。,基因重组是靠,DNA,连接酶将适当切割的,DNA,即目的基因与载体共价连接。,DNA,连接酶能催化相邻或两侧的,DNA,上裂口核苷酸裸露的,3,-,羟基和,5,-,磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的,DNA,裂口连接起来。在分子克隆中中，最有用的连接酶是来自于,T4,噬菌体的,DNA,连接酶,T4,连接酶，该酶需要,ATP,作为辅助因子。,注意：,在连接之前，应结合研究目的基因的特性，来设计最终构建的重组体分子。,一、体外连接重组,DNA,的特点,1,、,DNA,体外连接减少了,DNA,分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，增加了转化效率；,2,、由于限制性内切酶产生的黏端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个,DNA,维持完整性，有利于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离；,3,、连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分子或者几个,DNA,片段头尾相连接的直线多联体。,基因重组克隆实质上就是,DNA,体外重组以及后续的转化过程。,亚克隆是指把,DNA,片段从某一类型载体无性繁殖到另一类型载体的过程。例如：重组,-,噬菌体 质粒,亚克隆通常是将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小,DNA,片段与另一个载体连接转化的程序。,注意：,进行连接反应时，要考虑载体,DNA,与,DNA,片段的比率。,例如：以自质粒载体形成环状分子，,1,：,1,。,以,噬菌体或,cos,质粒为载体，形成多联体分子，二者的比例相应的就高些。,第二节 基因重组对载体的要求与载体类型,根据重组连接的目的，可将载体分为克隆载体和表达载体。,一、克隆载体,如果所进行的重组连接暂时不考虑表达量的问题，只是为目的基因的获得或使该基因克隆、亚克隆或扩增、构建,DNA,文库，可以选择一般的克隆型载体。,例如：,M13,单链噬菌体载体,双链复制型和单链型。双链复制型可作为克隆载体，克隆外源基因后，可以其单链形式作为模板，复制后进行序列分析。,基因重组的目的，就是使外源基因能够大量的在宿主中扩增，因此常用的克隆载体是质粒。质粒能高拷贝复制，带有多个单一的酶切位点和抗药性标记。,质粒载体中没有强的启动子，因为只能作为克隆载体。,二、表达在载体,表达性载体能够使目的基因在宿主细胞内进行高效表达，载体具有强启动子和正确的终止子，能高效、高拷贝地转录目的基因，并产生稳定的,mRNA,和翻译蛋白质。,例如：要想获得大量的目的基因的表达产物,表达型载体,在为了获得目的基因克隆的基础上，想使目的基因的表达产物容易检测,表达型载体,（一）、根据目的基因产生的蛋白质序列，表达载体可分为融合型表达载体和非融合型表达载体。（第十章）,（二）、强启动子组建的高表达载体一般有三类：,1,、含,噬菌体的,PL,启动子的质粒：,噬菌体的,PL,启动子是一个很强且易于调控的启动子。,例如：质粒,pPLa2311,就是在质粒,pBR322,中加入,PL,启动子的质粒载体。,2,、含,lac,启动子的质粒：,lac,启动子是大肠杆菌乳糖操纵子内半乳糖酶基因（,lacZ,基因）前的一个强启动子。,例如：质粒载体,Pop203-13,和,pB-galBC,。,3,、含,trp,启动子的质粒：,trp,是大肠杆菌色氨酸操纵子中的强启动子。,例如：,pNCV,质粒载体，曾经成功用于人流感病毒血凝素和口蹄疫病毒,VP3,抗原的表达。,为了进一步提高启动子的强度，使目的记忆高效表达，将上述的,lac,启动子和,trp,启动子串联起来，提高了转录速度。例如,pTAC12,质粒载体。,病毒载体大都含有较强的启动子，能保证插入的外源基因有效转录和表达，且转染的效率要高于转化，因而也长作为目的基因的表达载体。,第三节 连接前的处理,为了提高连接效率，需要在连接前将载体,DNA,和目的基因分别进行处理。,一般采用内切酶法将载体,DNA,分子切割成可与外源基因连接的线性分子。载体,DNA,通常有许多酶切位点，但并不是所有的酶切位点可用于重组切割。,一、理想的酶切位点应符合下列几个条件,1,、位于载体上特定的酶切位点要尽可能的少，最好是单一酶切位点，这样才能保证目的基因和载体,DNA,以最该的概率正确组合；,例如：,pBR322,上的,Bam,（,tet,r,）和,Pst,（,amp,r,），通过插入失活和,“,影印法,”,筛选重组体。,2,、在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。,例如：高效表达质粒,pMH621,的,gal,位点前有一个,OMP,多肽基因启动子,OMPF,，外源基因插入后可表达出外源基因与,OMP,多肽融合的蛋白。,OMP,多肽是细菌外膜蛋白的主要成分，因而可使外源基因在细菌外抹上表达，有利于产物的收获和提取。,3,、选择的载体必须在连接重组后对基因转录和翻译过程中的编码区读框不变。,在基因重组前，除载体,DNA,要处理外，目的基因也要进行切割和修饰，才能进行有效连接，而且必须考虑目的基因插入载体后与载体启动子之间的距离，务必要使目的基因在转录时处于正确的阅读框架之中，以便表达出原有的多肽序列。,载体,DNA,和目的基因,DNA,的连接，按,DNA,片段末端性质的不同，目前可用下述的几种方法进行连接：,黏性末端连接法,平端连接法,同聚物加尾连接法,人工接头连接法,第四节 黏性末端连接,一、黏性末端（黏端）连接有三种方式：,单酶切位点的黏端连接,双酶切片段的定向克隆,不同限制酶切位点的黏端连接,二、单酶切位点的黏端连接,由同一限制性核酸内切酶切割的不同,DNA,片段具有完全相同的末端。,1,、切割后的,DNA,片段要满足一下两点要求：,酶切割后产生单链突出的黏性末端,酶切位点附近的,DNA,序列不影响连接,哺乳动物,DNA,片段,细菌质粒载体,DNA,CCGG,CCGG,GGCC,GGCC,限制酶,Hpa,消化,CGG,C,GGC,C,+,CCGG,GGCC,CGG,C,C,GGC,混合、退火,T4DNA,连接酶,重组质粒,图：同一限制性酶切,DNA,黏性末端连接,2,、同一限制性内切酶酶切后的片段，连接过程中可能产生以下几种结果：,基因之间的连接,载体,DNA,之间的连接,载体,DNA,头尾之间的连接,载体,DNA,与目的基因之间的连接,自身环化,自身环化是最常见的干扰重组的因素，实际操作中必须控制自身环化现象的发生。,图,3,、优缺点,同限制酶切位点连接的方法是最简单也是最方便的克隆途径。但该方法又有外源,DNA,与载体,DNA,自身都容易环化、可双向插入、多拷贝插入、高背景和假阳性等缺点。,4,、相应的措施,（,1,）、克服高背景：,载体与外源,DNA,自身的环化不利于重组连接，大大降低了阳性克隆率，又使非重组载体造成高背景。,通过调整反应时外源,DNA,和载体,DNA,的浓度来限制载体,DNA,自身环化，或者通过遗传学技术来鉴别重组体与非重组体。,（,2,）、保证定向插入：,由于是单一位点，目的基因可以以不同方向插入载体。对于克隆扩增问题不大，因为克隆上去的基因再重组时又要切下来；对于表达载体目的基因必须按,5,3,方向克隆在启动子下游，目的基因的转录是从起始密码子向终止密码子方向定向转录的，一旦启动子与目的基因编码方向相反就不会正确转录目的基因的,mRNA,。,（,3,）、克服载体自身的环化：,连接过程中，载体自身除了环化外，还能形成串联寡聚物。,用高浓度的,DNA,（目的基因：载体为,3,：,1,）和牛小肠碱性磷酸酶（,CIP,）,处理载体，去除,5,P,使之不能自身环化，缺口在宿主内可得到修复。,图,三、双酶切片段的定向克隆,以两种不同的限制性内切酶切割目的基因，使之产生两个不同黏端，对载体也同样的处理，形成载体,DNA,和外源,DNA,两端为非同源的黏端，来防止,DNA,自身环化，且只能在,DNA,连接酶的作用下，载体,DNA,和外源,DNA,片段以两端互补来实现,DNA,定向插入。（图）,定向克隆：指使外源,DNA,片段定向插入到载体分子的克隆方案。,1,、双酶切片段的定向重组方式的优点：,（,1,）、外源,DNA,只能以一个方向定向插入到重组质粒，以便目的基因的正确转录和表达；,（,2,）、质粒载体与外援,DNA,结合处的限制酶切位点仍然保留，有利于目的基因的分离和提取；,（,3,）、由于不会发生环化，转化率较高，转化后的细菌克隆大多数携带有插入目的基因的重组质粒。,2,、定向克隆的连接方式,（,1,）、外源,DNA,和载体,DNA,经过两个内切酶酶切后为非同源互补的黏端连接（黏,-,黏连接）；,（,2,）、外源,DNA,和载体,DNA,经过两个内切酶酶切后一侧为互补的黏端，一侧为平端或由非互补的黏端不平后产生的平端连接（黏,-,平连接）；,其中黏,-,黏连接效率非常高，是重组方案中最有效而简捷的途径。,四、不同限制酶切位点的黏端连接,由两种不同的限制性内切酶切割的,DNA,片段，具有相同类型的黏性末端，彼此称为匹配末端（配伍末端），末端的连接方式与单酶切位点的黏端连接方式类似。,同尾限制酶：,来源各异，识别的靶序列不同，切割后产生相同的黏性末端，能够通过其黏性末端之间的互补作用彼此可以被,DNA,连接酶重组。,（图）,同裂限制酶：,来源不同，识别的相同的序列，但切割位点不同。,经过同裂限制酶切割后的,DNA,与载体连接前，还必须进行处理。,第五节 平端连接,一些限制性内切酶如,Hae,和,Hpa,切割产生的,DNA,片段没有黏性末端，而是平末端。具有平端的酶切载体只能与平端的外源基因连接。,平端连接比黏性末端连接要困难得多，连接效率只有黏端连接效率的,1%,，因此在平端,DNA,的连接中，需要加大,DNA,和连接酶的浓度。在该条件下，常出现多联体连接。,二、人为处理黏端成为平端的两种方法：,1,、添补法：利用,DNA,聚合酶,的大片段（,Klenow,片段）将,5,突出黏性末端补齐，补齐后去磷酸化处理后，用,T4DNA,连接酶连接。（图）,2,、削除法：利用,DNA,聚合酶的,3,-5,外切酶酶活性，对含,3,突出的黏性末端补平，或利用,S1,和,Bal31,等核酸酶将目的基因黏端的单链突出部分削平后连接。,3,端突出端只能切平是因为,DNApol,合成需要引物（加在,3,OH,末端）且只能按,5,3,方向。（图）,第六节 人工接头连接,人工接头（衔接物或适配子）：指人工合成的具有一个或是个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端,DNA,短序列。其分子长度约为,8-12bp,，具有一定碱基序列，在其序列内具有一个或多个限制性内切酶识别位点。利用人工合成的接头可以很方便地将具有平端的,DNA,片段结合到可怜载体上。,一般用连接酶将人工接头连接到外源片段的两端，利用内切酶切割成黏性末端，最后利用连接酶连接。,此方法适用于没有所需限制酶切位点的外源片段。,1,、人工接头连接平端的,DNA,片段（图）,2,、人工接头连接黏端的,DNA,片段,注意：,人工接头的选择要以外源片段上的限制酶识别位点为主，要避免二者具有相同的酶切位点，都在会给后续其它操作带来麻烦。,3,、改进的,5,-OH,黏端机构的,Bam,H,人工接头的连接机理（图）,重组连接完成后，可通过凝胶电泳使未连接的人工接头和内切酶切割的,DNA,片段与重组体分离，降低高背景的影响。,第七节 同聚寡核苷酸末端连接,同聚寡核苷酸末端连接（同聚物加尾连接、同聚末端连接）：,在脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）的作用下，可以在,DNA,的,3,-,羟基端合成低聚多核苷酸（添加同聚物造成延伸部分）。,如果把所需要的,DNA,片段加上低聚腺嘌呤核苷酸（,dA,），而把载体分子接上低聚胸腺嘧啶核苷酸（,dT,），那么由于二者之间能形成氢键互补，同样可以通过,DNA,连接酶作用形成重组体分子。（图）,注意：,1,、末端转移酶在二甲砷酸缓冲液存在下，可以不需要模板在线状,DNA,分子末端添加上一个个脱氧核苷酸残基；,2,、对末端转移酶来说，平末端的,DNA,分子并不是最佳底物，但只要将缓冲液中的镁离子换成钴离子，则也能有双链末端延伸出同聚物末端；,3,、末端转移酶不具有特异性，,4,中,dNTP,中的任何一种均可作为前体物，因此可以产生由单一核苷酸所构成的,3,同聚物末端。,THE END！,