实验十一蛋白质含量的测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验十一 蛋白质含量的测定,1,一、目的要求,1.学习和掌握蛋白质含量测定的原理,2.掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度的操作技术,二、原理,2,微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量,被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。,因为蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。,3,Folin酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度,蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu,2+,形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸磷钨酸试剂)，蛋白质铜络合物能还原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。,4,紫外分光光度法测定蛋白质浓度,由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD,280,)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。,利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。,5,总蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）,准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是202000g/ml；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20g/ml,快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便,经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量,不受样品中离子型和非离子型去污剂影响,检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝,6,基本原理：,碱性条件下，蛋白将Cu,2+,还原为Cu,+,， Cu,+,与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。,7,BCA蛋白质检测流程：,8,考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度,考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。,9,Coomassie Dye-Based 蛋白质定量,PROTEIN,+,A,max,= 595nm,BLUE,Acid,Coomassie G-250,Protein - Dye,Complex,O,CH,2,CH,3,NH,C,CH,3,CH,3,N,CH,2,SO,3,-,CH,3,CH,2,N,CH,2,CH,2,CH,3,SO,3,Na,+,10,三、 操作方法,1.标准曲线制作,取14支试管，分两组按下表平行操作。,试管编号 0 1 2 3 4 5 6,标准蛋白含量(,g) 0 10 20 30 40 50 60,标准蛋白溶液(mL) 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06,待测蛋白质溶液(mL),蒸馏水(mL) 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04,考马斯亮蓝试剂(mL) 2.5 mL,摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色 OD,595nm,以OD,595nm,为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。,11,2. 未知样品蛋白质浓度的测定,测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的OD,595nm,值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。,12,四.注意事项,（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。,（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。,13,五思考题,(1)与其它测定蛋白质浓度的方法相比，考马斯亮蓝染色法测定有何优点？,14,15,