生猪重要疫病样品采集要求及实验室检测意义

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生猪重要疫病样品采集要求,与实验室检测意义,李峰 研究员,山东省滨州畜牧兽医研究院,山东省生猪创新团队滨州综合试验站,生猪重要疫病实验室检测技术研修班,分享内容,实验室检测的重要意义,实验室检测的主要内容,生猪主要疫病样品采集要求与注意事项,其他样品采集要求,实验室检测的重要意义,明确所发生的疾病种类：,传染性因素：细菌、病毒、支原体、其它微生物；,非传染性因素,单纯感染,/,混合感染,是否为人兽共患病,病原分子生物学检测分析,区域优势毒株基因型分析,病原分子进化与演变,病原分子序列与疫苗比对,细菌培养与药物敏感性试验,细菌初步鉴定：毒力、血清型,药物敏感性试验：解决合理用药问题,自家疫苗试制：技术储备,开展抗体检测,疫苗免疫抗体监测与评价,野毒感染状况调查与评价：,PRV,、传胸,免疫程序调整与优化：母源抗体检测,疫病净化评价,类别,免疫场,非免疫场,合计,30头,30头,30头,30头,场 数,18,17,2,6,43,阳性场数,10,6,1,3,20,阳性场占比,%,55.56,35.29,50.0,50.0,46.51,样品数,187,66,22,28,303,阳性数,43,17,7,10,77,样品阳性率,%,22.99,25.76,31.82,35.71,25.41,猪伪狂犬,gE,抗体检测情况统计,实验室检测的主要内容,细菌的染色,形态学观察,培养基的制备,细菌分离培养,纯化,细菌的生化试验,药物敏感试验,病猪的剖检,病猪病料的采集、保存,总,RNA,的提取,反转录,聚合酶链式反应（,PCR,）,猪瘟病毒抗体,猪伪狂犬病病毒,gPI,抗体,(,野毒,),猪流感血凝抑制试验,猪细小病毒病乳胶凝集试验（,LAT,）,猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体,DNA,提取,PCR,血清学检测,分子诊断,细菌分离,结果分析,生猪主要疫病样品采集要求,采样原则,1、,适时采集,：尽可能采集到新鲜样品。用于分离病原体的，须在病初发热期或出现典型临诊症状时采集；若制备血清，空腹时采血。尸体上采样，应在动物死后立即采集。,2、典型采样,：样品具有代表性。选择典型动物，即未经药物治疗、病状典型的动物；选择典型材料，病原体含量最高的材料；尸体采样，采集有病变组织、器官或病变最明显、最典型的部位。,3、合理采样,：群体发病时，至少采,5头动物的病料。每一种样品应有足够的数量。,4、无菌采样,：无菌操作，尤其是供微生物学检查和血清学检查的样品,5、安全采样,：注意人员安全，防止感染，防止病原扩散造成环境污染。,病理剖检,腹部朝上平放,切开四肢,颈部淋巴结,股内则淋巴结,剖检颌、颈部,皮下组织、颌下淋巴结观察,横切胸骨柄，暴露胸腹腔,观察胸腹腔器官变化,纵切胸骨柄,取出胸腔器官,剖开颅腔,暴露脑部,器官,症状,/,病变,疑似疾病,体表,耳尖、屁股、腹部发紫,微循环障碍：猪瘟、弓形体,背部发紫，规则菱形，边缘整体,猪丹毒,全身通红,链球菌,鼻子流血和,/,泡沫,胸膜肺炎,背部点状出血、毛孔出血、皮肤发白,附红细胞体、蓝耳病,会阴、臀部、四肢出现周边紫色，中间白色圆形、边缘紫褐色纽扣状坏死,圆环病毒,依据剖检病变推导可能发生疫病,淋巴结,颌下淋巴结肿大，出血性坏死,全身淋巴结有大理石样出血变化,腹股沟浅淋巴结水肿、切口外翻，表面苍白，渗出透明液体,咽、颈及肠系膜淋巴结黄白色干酪样坏死灶,淋巴结充血、水肿、小点状出血,支气管淋巴结、肠系膜淋巴结髓样肿胀,猪炭疽、链球菌病,猪瘟、蓝耳、猪肺疫,圆环病毒,2,型,猪结核,急性猪肺疫、猪丹毒、链球菌病,猪气喘病、猪肺疫、传染性胸膜肺炎、副伤寒,血液,血液黑或发紫，不凝固,中毒，内源性毒素：弓形体、胸膜肺炎、链球菌、猪丹毒,血液不凝固、稀薄,贫血，蓝耳、附红细胞体,呼吸道,喉头出血,猪瘟,扁桃体化脓、出血,猪瘟、伪狂犬,喉头有泡沫,蓝耳、副猪、传胸,气管有很多粘液,细菌性疾病,肺,出血斑点,纤维素性肺炎,心叶、尖叶、中间叶肝样变,水肿，小点状坏死,粟粒性、干酪样结节,表面零星、边界清楚、湿润肉样变,猪瘟,猪肺疫、传染性胸膜肺炎,气喘病,弓形体病,结核病,流感,心脏,心包积液,心包炎、心外膜炎（绒毛心）,心外膜斑点状出血,心肌条纹状坏死带,心内膜出血,心瓣膜呈菜花样,心肌内有米粒大灰白色包囊泡,副猪、传胸,副猪、传胸、气喘病,猪瘟、猪肺疫、链球菌病,口蹄疫,败血症,链球菌、慢性猪丹毒,猪囊尾蚴病,肝,淤血肿大,沙门氏菌,表面灰白色或灰黄色纤维素,沙门氏菌病、副猪、大肠杆菌,白色坏死点，,弥漫性坏死,沙门氏菌、伪狂犬、,霉菌毒素、中毒,脂肪肝,传染性胃肠炎、流行性腹泻、仔猪大肠杆菌,胆囊肿大、胆汁粘稠,沙门氏菌,胆囊肿大，胆汁呈黄色泥状,圆环病毒,脾,脾边缘有锯齿状出血、,梗死,弥漫性出血,淤血肿大，坏死,脾边缘有小点状出血,猪瘟,、仔猪副伤寒,猪瘟、猪丹毒、弓形体、猪肺疫,弓形体病，,霉菌毒素中毒（全）,仔猪红痢,胃,胃粘膜斑点状出血，溃疡,胃粘膜充血、卡他性炎症，呈大红布样,/,麦麸状假膜,粘膜下水肿,胃壁增厚,猪瘟、胃溃疡,猪丹毒、食物中毒,副伤寒,水肿病,水肿、大肠杆菌、魏氏梭菌,肠,乳糜管内无脂肪、出血,病毒性腹泻,乳糜管内有脂肪,细菌、球虫或营养性腹泻,肠壁有白色绿豆大肉芽肿、淋巴滤泡增生,沙门氏菌、食道线虫（大肠）、球虫（结肠、盲肠）,浆膜出血,猪瘟,回盲瓣出血、坏死，盲肠扣状肿,猪瘟,肠粘膜出血,流感、梭菌性肠炎、增生性肠炎,肾,苍白，针尖状出血,猪瘟、伪狂犬,淤血、肿大,猪丹毒、梭菌、链球菌（,紫红色、红棕色,）；蓝耳（,紫黑色,）；增生性肠炎,（灰黑色，肾乳头淡黑色）,灰白色、表面隆突不平,圆环病毒,膀胱,粘膜层有出血斑点,猪瘟,睾丸,1,个或,2,个睾丸肿大、发炎、坏死或萎缩,乙型脑炎、布氏杆菌病,关节,肿大、积液,副猪、链球菌,依据病种确定主要采集病料,病名,病原,主要临床症状,特征病理变化,主要病料采集,实验室诊断,猪瘟,HCV,体温,41,左右，脓性结膜炎， 皮肤红斑点，指压不退色，先 便秘后腹泻，公猪包皮囊积尿， 小猪多有神经症状。,实质器官多发性出血性为特 征的败血症病变，肾脏有出 血点或斑，尿道、膀胱、喉 头均有出血点，脾脏边缘梗死。,扁桃体、淋巴结、脾脏、,肾脏和血清,接种,PK15,细胞、分离病毒；,ELISA,、,RT-PCR,、,GIA,检测病原,猪繁殖与呼吸障碍综合征（蓝耳病）,PRRSV,母猪流产，早产，死胎，木乃伊胎。胎儿大小比较一致，少数病猪双耳、尾部等发生短暂性皮肤紫绀。哺乳仔猪呈结膜炎，呼吸障碍及流鼻涕。青年 猪见呼吸道症状。,间质性肺炎；肺水肿；淋巴 结肿大呈褐色。,病猪的肺、流产胎儿的肠和腹水、母猪血清、鼻拭子、粪便、扁桃体、脾、淋 巴结,接种,Marc-145,细胞,分离鉴定；,ELISA,方法检测抗体；分子生物学,RT-PCR,病名,病原,主要临床症状,特征病理变化,主要病料采集,实验室诊断,猪伪狂 犬病,PRV,引起怀孕母猪流产，以死胎为主。仔猪也可出现体温升高，呼吸困难，下痢和特征性神经症状，,15,日龄以内仔猪易感， 病死率可达,100%,。,木乃伊胎或死胎重吸收。扁桃体白色溃疡或坏死灶，肝脏表面白色坏死点，脾脏白色坏死灶。脑部水肿等。,扁桃体、脊髓、淋巴结、 脑组织,动物试验；接种,vero,细胞分离病毒；,PCR,检测病原。,猪圆环病毒病,PCV2,被毛粗乱，喜挤堆，精神沉郁， 呼吸急促，皮肤苍白，腹泻，消瘦。,淋巴结异常肿大、切面为白色。脾脏肿大，肾脏肿大呈土黄 色，并有散在的红色坏死斑 点，肺脏质地较硬似橡皮。,肺脏、淋巴结、肾脏,分子生物学,PCR,病名,病原,主要临床症状,特征病理变化,主要病料采集,实验室诊断,流行性腹泻,PEDV,水样腹泻，或者在腹泻之间有呕吐。呕吐多发生于吃食或吃奶后。一周龄内新生,仔猪,发生腹泻后,34,天，呈现严重脱水而死亡，死亡率可达,50%,，最高的死亡率达,100%,。,小肠扩张，内充满黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿。,粪便、肠内容物,接种,Vero,细胞，分离病原，,RT-PCR,检测。,传染性胃肠炎,TGEV,一般,2,周龄以内的仔猪感染后,12-24,小时会出现呕吐，继而出现严重的水样或糊状腹泻，粪便呈黄色，常夹有未消化的凝乳块，恶臭，仔猪明显脱水，发病,2-7,天死亡，死亡率达,100%,；在,2-3,周龄的仔猪，死亡率在,0-10%,。,主要病变在胃和小肠，呈现充血、出血并含有未消化的小凝乳块，肠壁变薄。,肠、肠内容物,接种,PK15,细胞分离病毒，分子生物学,RT-PCR,病名,病原,主要临床症状,特征病理变化,主要病料采集,实验室诊断,口蹄疫,FMDV,猪口腔粘膜、鼻吻部、蹄部以及乳房皮肤发生水疱和溃烂为特征。不同年龄的猪易感程度不完全相同，一般是越年幼的仔猪发病率越高，病情越重，死亡率越高。,仔猪心肌炎。,水泡皮、水泡液、心脏、血清,ELISA,检测抗体,猪流感,SIV,发病初期病猪体温突然升高至,40.3,41.5,，厌食或食欲废绝，极度虚弱，常卧地。呼吸急促、腹式呼吸、阵发性咳嗽。从眼和鼻流出粘液，鼻分泌物有时带血。病猪挤卧在一起，难以移动，触摸肌肉僵硬、疼痛，打嗝。,剖检可见喉、气管充满含有气泡的黏液，黏膜充血，肺间质增宽，淋巴结肿大、充血，脾肿大，胃肠黏膜有卡他出血性炎症，胸腹腔、心包积液。,肺、脾、淋巴结、血清、鼻拭子,接种,vero,细胞、鸡胚分离病毒，分子生物学,RT-PCR,供病原学检查材料的采集、处理,1,、血液。前腔静脉或耳静脉采血。,2,、分泌物和渗出液：采集口腔、鼻腔、喉气管、泄殖腔和阴道分泌物时，通常是将棉棒插入天然孔反复旋转后蘸上分泌物，然后将样品端剪下。,3,、淋巴结、内脏器官、肌肉：淋巴结连带周围脂肪整体采集；内脏器官和肌肉，通常取病变最明显的部位。,4,、水疱皮：将病变部位清水清洗，剪取新鲜水疱皮,3,5g,放入灭菌小瓶内,5,、肠管：选取至少,6cm,肠管，两端结扎，从结扎线外端稍远端剪断。,以上病料采集后，立即放入灭菌的玻璃容器，密封，外贴标签。做细菌学检查的，尽快冷藏。做病毒学检查的，尽快冷冻或加入病毒保护液。常用的病毒保护液：含抗生素的磷酸盐缓冲液、,50%,甘油磷酸盐缓冲液。,供血清学检查材料的采集、处理,（,1,）采血。用于制备血清的血液采出后不加抗凝剂，不进行脱纤处理。大中动物每头不少于,5ml,。,（,2,）制备血清。采血时使血液直接流入试管，加塞，立即摆成斜面，待血液凝固后竖起试管，使血清自然析出。也可将血液离心分离血清。,作血清学检测的血液，在采集、运送、制备血清过程中，均应避免震动和冻结，防止溶血，影响检测结果。,（,3,）血清保存。制备的血清若能在一周内检测，,4,冷藏，若需保存较长时间，应于,30 ,冻结。,猪的前腔静脉采血方法,猪只的固定。公母猪用保定绳固定，要求尽可能吊得高一点，使猪的头颈与水平面呈,30,度以上角度,(,如图,1),，这样，即方便采血人员察看采血部位，又使前腔静脉向外突出，静脉血充胀。,20kg,以上的中大猪，由,1-2,个饲养员用捉猪器,(,或保定绳,),拉住，头昂起，偏向右侧,(,如图,2,、,3),；,20kg,以下的小猪，可由,1-2,个饲养员抓起，倒立，后背紧靠在栏架上,(,如图,4),。,图,1,公母猪保定,图,2,中猪固定和采血,图,3,大猪固定和采血,图,4,小猪的保定与采血,选取合适的针筒和针头。,根据经验，公母猪宜选用,16#,50mm,针头,(,这种针头猪场不常用，但很多针头生产厂家都有生产，可以找兽医药械销售店联系购买,),；,30kg,以上的中大猪，宜选用,12#,38mm,针头；,10-30kg,小猪，可选用,9#,25mm(,一次性注射器常配的针头,),；,10kg,以下乳猪，应选择,9#,20mm,针头,(,一次性注射器所配的另一种规格的针头,),找准下针部位。,猪的前腔静脉，越往头部越浅，但也越细；越靠胸部越粗，但越深。所以，采血应选择适当的部位。小猪取血的部位太靠前，血管太小，很难扎中，而且扎中了也很难抽到血液，所以，小猪的采血部位应稍靠后。中大猪和公母猪血管比较大，往后太深，针头够不到血管，所以，应略靠前。根据我们的经验，,20kg,以下的小猪应采两前肢与气管交汇处,(,如图,4),，公母猪和,20kg,以上中大猪可选颈部最低凹处,(,如图,2,、,3,）。,下针和抽血。,小猪：,对准以上描述的部位，用针垂直刺入。拉紧针筒活塞，若针头扎中前腔静脉，可见到血液自血管源源流出，抽取所需的血量即可。,公母猪和中大猪：,对准下针部位，使针头偏向气管约,15,o,方向下针，拉紧针筒活塞，若扎中，可见血液流出。如果见不至血液流出，说明没有扎中，有可能是前腔静脉较深，可用手顶紧针筒，使针头扎深一点。,处理好所采的血液。,采到血液后，应立即将注射器内的血液沿着贮藏血液的容器（试管或青霉素空瓶）徐徐注入，不能有气泡，也不能振荡，同时倾斜放置好。也可放在注射器内倾斜放置好后送检。若要送检血清，夏天在常温下放置一段时间，冬天要放置在,25,37,温水中一段时间，以利血清析出。若需抗凝全血，在注射器或试管内需预先加入抗凝剂。,耳静脉采血方法,1),将猪站立或横卧保定，或用保定器具保定。,2),耳静脉局部按常规消毒处理。,3)1,人用手指捏压耳根部静脉血管处，使静脉充盈、怒张（或用酒精棉反复局部涂擦以引起其充血）。,4),术者用左手把持耳朵，将其托平并使采血部位稍高。,5),右手持连接针头的采血器，沿静脉管使针头与皮肤呈,300,450,角，刺入皮肤及血管内，轻轻回抽针芯，如有回血即证明已刺入血管，再将针管放平并沿血管稍向前伸入，抽取血液。,实验室检测策略,以前：,我们的误区,猪群发病了，采发病猪的血，化验。,结果：无所适从。,结论：化验无用，没有帮助。,缺乏,有效,的实验室支持，是造成盲目用药、,用苗的原因之一,服务承诺,服务口号：,快速、高效、及时,服务承诺：,对于已有检验方法的检验项目，,48,小时,内给出准确检验结果；,对于尚无检验方法的项目，,5,个工作日,内给予相关疫病的分子检测检测结果；,对使用过我公司研发的试剂盒的客户，,第一时间,安排专职的研究人员，提供全程技术支持服务；,