高效液相色谱分类1

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,三 分离类型,液固吸附色谱,离子交换色谱,液液分配色谱及键合相色谱,尺寸排阻色谱,1,1 液固吸附色谱,液固色谱是最古老的色谱法。其分离原理是溶质分子和溶剂分子在作为固定相的固体吸附剂活性表面上的竞争吸附。因此，液固色谱又常称为吸附色谱或液固吸附色谱。,液固吸附色谱适用于分离中等分子量的油溶性样品，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。凡是能用薄层色谱成功分离的化合物，都可用液固色谱进行分离。,对强极性分子或离子型化合物有时会发生不可逆吸附此外，液固色谱分离同系物的能力较差。,2,固定相,与流动相,最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝,流动相：有机溶剂,选择流动相的基本原则是 极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相,流动相的含水量对分离影响很大,3,固定相,极性吸附剂：硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛、聚酰胺等,非极性吸附剂：活性炭,4,极性吸附剂,酸性：硅胶、硅酸镁,酸性吸附剂适于分离 碱、如脂肪胺和芳香胺,碱性：氧化铝、氧化镁、聚酰胺,碱性吸附剂适于分离酸性溶质，如酚、羧酸和吡咯衍生物,5,硅胶的表面结构和性质,游离型硅羟基,氢基化硅羟基,（包括束缚型和活泼型）,硅氧桥,6,硅胶处理,未经加热处理：,表面羟基被物理吸附水覆盖，没有吸附活性,150200度长期加热：,表面吸附水完全失去，硅胶上只剩下表面羟基，相邻羟基形成氢键，表面吸附活性最强,200400：,硅羟基脱水成硅氧烷基,700：,全部硅羟基不可逆变为硅氧烷基,7,8,硅胶的重要性质,比表面积：多孔固体的比表面积Sp外表面Se和内表面Si之和，比表面积越大，溶质的保留值越大。孔径与比表面积成反比。比表面积越大，孔径越小。根据孔径大小，硅胶可分为：小孔硅胶（50nm）和中孔硅胶（2到50nm）小孔硅胶对分子量大的溶质会产生排阻现象。而且表面积上的游离硅羟基数也减少。所以小孔硅胶可能造成不可逆吸附。,孔径增大时，多空硅胶的机械强度下降。,9,10,流动相,吸附色谱控制分离选择性和分离速度主要靠选择合适的流动相来实现,复杂混合物必须用二元或三元混合溶剂体系来提高分离选择性。溶剂极性相差很大时注意分层问题,流动相含水率的控制对分离影响很大,11,12,离子交换色谱,离子交换色谱以离子交换树脂为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换，根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。,13,14,固定相,与流动相,固定相为离子交换树脂,阳离子交换树脂,阴离子交换树脂,离子交换树脂的流动相最常使用水缓冲溶液，有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度,15,16,17,-RECOMBINANT -BUNGAROTOXIN,Column,:,PolyCAT A, 4.6x200mm, 5m, 300(Part # P204CT0503),Mobile Phase:,60 linear gradient, 50-300 mM NH4OAc, pH 6.0,Column:,PolyCAT A, 4.6x200mm, 5m, 300(Part # P204CT0503),Mobile Phase:,60 linear gradient, 50-300 mM NH4OAc,with 40% ACN in both mobile phases, pH6.0,Courtesy of Robert Rogowski and Edward Hawrot,有机溶剂对蛋白离子交换的影响,18,2 液液分配色谱及键合相色谱,在液液色谱中，一个液相作为流动相，而另一个液相则涂渍在很细惰性载体或硅胶上作为固定相。流动相与固定相应互不相溶，两者之间应有一明显的分界面。分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。,19,固定,相,液液色谱的固定相由载体和固定液组成,全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠，颗粒小，,柱效高,是目前使用最广泛的一种载体,液相色谱中，,由于流动相参与选择作用,只需几种不同极性的固定液即可。如,，,氧二丙腈（ODPN），聚乙二醇（PEG），十八烷（ODS）和角鲨烷固定液等。,20,流动相,除一般要求外，流动相对固定相的溶解度还要尽可能小，因此固定液和流动相的性质往往处于两个极端,正相分配色谱,：,以极性物质作为固定相，非极性溶剂作流动相的液液色谱，称为，适合于分离极性化合物；,反相分配色谱：,选用非极性物质为固定相，而极性溶剂为流动相的液液色谱，这种色谱方法适合于分离芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物。,21,键合相色谱,液液色谱尽管选用与固定液不互溶的溶剂作流动相，但在色谱过程中固定液仍会有微量溶解。以及流动相经过色谱柱的机械冲击，固定相会不断流失。,70年代初发展了一种新型的固定相,化学键合固定相,。这种固定相是,通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上,，代替机械涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。,22,制备化学键合固定相,化学键合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。键合相可分为四种键型：,（1）硅酸酯型（=Si-O-C=）键合相,（2）硅氮型（=Si-N=）键合相,（3）硅碳型（=Si-C=）键合相,（4）硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）键合相,将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。,23,24,化学键合色谱优点,（1）适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非极性、极性和离子型化合物。,（2）由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。,（3）键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。,（4）固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。,25,0,2,4,6,8,10,分钟,第一次进样,第5020次进样,1:,磺胺,2: 磺胺嘧啶,3: 磺胺塞唑,4: 磺胺甲基嘧啶,5:磺胺甲嘧啶,6: 磺胺杀定,色谱条件,色谱柱：Symmetry C8 3.9 mm X 150mm,保护柱：Sentry 保护柱 3.9 mm X 20 mm,流动相：水：甲醇：冰乙酸79：20：1,1,2,3,4,5,6,柱 寿 命,26,不同批次填料色谱柱的重复性,色谱柱：Symmetry C 8 3.9 mm X 150mm,保护柱：Sentry 3.9 mm X 20 mm,样 品：Barbiturate Standard,流动相：100 mM 磷酸钾缓冲液,pH 6.9：乙腈：水20:30:50,Batch A,Batch B,Batch C,0 2 4 6 8 10 12,27,正相键合色谱法,在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基（-C N）、氨基（-NH,2,）、二醇基（DIOL）键合相。流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。,一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分配比,K,值，随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。,该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。,28,29,反,相键合色谱法,在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C,18,H,37,（简称O D S或C,18,）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。,目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。,在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。,30,31,流动相,有机调节剂种类（甲醇、乙腈等）,有机调节剂含量（）,pH,缓冲液种类（磷酸盐、乙酸盐等）,离子强度（盐及缓冲液浓度）,离子对试剂（烷基磺酸、季胺盐等）,32,有机调节剂种类的影响,33,有机调节剂含量的影响,34,35,pH的影响,36,37,38,pH对电离物质分析的影响,39,pH对非电离物质分析的影响,40,41,pH精确度对分离的影响,42,尺寸排阻色谱,排阻色谱法也称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法，是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。,排阻色谱法洗脱体积总是位于V,0,至V,0,V,p,之间，因此峰容量有限，整个色谱图上只能容纳小于1012个色谱峰，分离度较低，不能完全分离一个复杂含多个组分的样品,尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。,43,44,排阻色谱的固定相,（1）,软性凝胶,如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶涨到它干体的许多倍。它们适用于水溶性作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜在高效液相色谱中。,（2）,半刚性凝胶,如高交联度的聚苯乙烯。常以有机溶剂作流动相。,（3）,刚性凝胶,如多孔硅胶、多孔玻璃等，它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作,。,45,46,流动相,排阻色谱法中主要依据体积大小分离，与样品流动相之间的相互作用无关，所以在排阻色谱法中不采用改变流动相组成的方法改善分离度。流动相的选择主要考虑：,1流动相对样品应有较好的溶解能力，尤其是难溶高分子样品,2流动相应与凝胶相互匹配，防止凝胶的吸附作用,3应与检测器匹配,4尽量采用低粘度溶剂，在为增加样品溶解度采用高柱温分析时应采用高沸点溶剂，并保持在分离温度下也有较低的粘度,47,凝胶渗透色谱,四氢呋喃是最常用的流动相，使用时注意THF贮存过程中会生成过氧化物，蒸馏THF时应有防护罩，并留下10停止蒸馏，以防爆炸,邻二氯苯、1，2，4三氯苯、间甲酚等可在高柱温下使用,凝胶过滤色谱,使用水为基体具有不同pH值的多种缓冲液作流动相。为消除不希望存在的吸附作用与疏水作用，通常加入少量无机盐，入NaCl、KCl、NH4Cl以维持流动相的离子强度为0.1-0.5。当需洗脱生物大分子蛋白质时可加入变性剂，如6mol/L的盐酸胍，8mol/L脲或0.1%十二烷基磺酸钠（SDS）、聚乙二醇6000或20M，并应在低流速（0.25-0.5mL/min)下运行。pH应在48以免破坏硅胶,48,四 生物样品前处理,样品处理是现代化学分析中的一个关键步骤。有人估计在分析实验室中6080的工作花在样品处理上。,一般样品预处理要达到的目标如下：,1去除基体中干扰样品分析的杂质，提高分析精度和分离效果；,2提高被测定化合物检测灵敏度；,3提高样品与流动相的兼容性，从而改善定性定量分析的重复性,49,去蛋白,液液萃取,液固提取,化学衍生,50,去蛋白,沉淀法,酸沉淀,有机溶剂,碱性溶液金属盐,硫酸铵,超滤法,透析,51,52,53,液液萃取,液液萃取最早被用于样品预处理，这一方法可把有机化合物直接萃取到与水不相容的有机相中液液萃取的基本原理是分配定律,54,优点,通过萃取可将被测组分自大量内源性物质中分离出来，减少杂质对测定的干扰；,操作简单快速、经济实用；,可将萃取液蒸发，使组分富集。残渣可用与HPLC相适应的溶剂溶解后进样。并且可进一步净化，有利于延长色谱柱的寿命；,可一次进行多个样品的萃取。,55,液液萃取,选择提取溶剂,由pH控制提取,混合及乳化形成,去溶剂,提取剂性分子,提取次数及内标的加入,56,提取溶剂,1. 沸点低，挥发容易,2. 粘度低，与样品的基体相混合,在能溶解样品的前提下极性尽可能低,注意：,1. 溶剂稳定剂及添加剂,2. 溶剂不纯物,57,一些常用液液萃取有机溶剂,58,由pH控制提取,为了使萃取过程有良好的回收率，应当调节水相的pH值使溶质以中性状态存在,利用pH对分配系数的影响，可以将有机酸有机碱从水相萃取到有机相，也可将有机相中的弱酸弱碱萃取到水相,还可通过pH值的调节，把样品分成酸性中性和碱性馏分,59,乳化,在液液萃取中经常遇到的问题是乳状液的生成通常乳状液很难破碎，也很难由超声波和超滤分离由于乳状液中溶解一定量的样品，因而往往会降低样品的回收率和重复性通过严格控制二相的混合过程和增加有机相溶剂的体积可以部分或完全消除乳状液的生成,60,去溶剂,液液萃取的萃取液含有大量的有机溶剂，在很多情况下应将有机溶剂除去通常通过加温或常温将有机溶剂挥发掉由此产生的问题是：,(1)污染大气环境；,(2)在加热挥发时有可能导致被分析样品的热分解,61,提取剂性分子,强有机酸、强有机碱：离子对试剂,金属离子：鳌合剂,62,提取次数及内标的加入,HPLC一般提取一次,内标在样品处理前加入,63,液固提取,以液相色谱分离机理为基础，以经典的液相色谱用于样品制备的方法。,64,优点,快速：平均缩短2/3的时间,成本低：试剂消耗少，有毒废物少,回收率高：样品转移步骤少,高精确度：没有交叉污染,样品处理步骤少：没有乳化问题,对不稳定化合物影响少：挥发量小,更安全：溶剂及样品暴露的机会少,易自动化：可同时批量处理大量样品,65,步骤,固定相活化,初溶剂：净化固定相,终溶剂：建立合适的固定相环境,固定相不能抽干,样品上柱：溶剂尽可能弱,淋洗：溶剂略强或等于上样溶剂,分析物洗脱：仔细选择溶剂,66,步骤,67,选择溶剂的其他注意点,混合溶剂：,上样、淋洗、洗脱过程中溶剂极性变化太大，可用混合溶剂的方法解决。,溶剂互溶性,后一种溶剂与前一种必须互溶,洗脱溶剂的极性,太强洗脱溶剂不能直接上样用弱溶剂调节到合适的溶剂总强度,68,方法的建立,流速：慢、稳定,样品容量：一般13,洗脱分布图,69,70,71,化学衍生,化学衍生是指借助化学反应给样品化合物接上某个特定基团，从而改善样品混合物的检测性能和分离效果。,目的：,提高对样品的检测灵敏度。,改善样品混合物的分离度。,适合于进一步做结构鉴定，如质谱、红外或核磁共振等。,72,进行化学衍生反应应该满足如下要求：,对反应条件要求不苛刻，且能迅速、定量地进行。,对某个样品只生成一种衍生物。反应副产物包括过量的衍生试剂不应干扰被测样品的分离和检测,化学衍生试剂方便易得、通用性好,73,衍生产物用紫外可见检测器检测,衍生产物用荧光检测器检测,74,紫外可见,胺类化合物,卤代烃类：2,4-二硝基氟苯(FDNB),仲胺鉴别,酰氯类：对硝基苯甲酰氯，伯胺及仲胺,-,氨基酸,异硫氰酸苯酯：检测极限50,10,-12,mol,反应时间长，柱前衍生,茚三酮：柱后衍生,羧酸,与卤代烃，如对硝基苄基溴反应得酯，酸的钾盐在冠醚催化下酯化,羟基化合物,酰氯也是羟基化合物的衍生试剂，如对甲氧基苯甲酰氯,羰基化合物,典型的是2,4-二硝基苯肼,75,荧光,邻苯二甲醛（OPA),伯胺，反应要加硫醇，柱前柱后衍生都可以,荧光胺,伯胺，碱性条件下才有荧光，不能柱前衍生,丹酰氯,氨基酸、胺类及酚类化合物，伯胺仲胺都反应，反应时间长，柱前衍生,芴代甲氧基酰氯（FMOC-Cl),伯胺仲胺都反应，产物稳定，柱前衍生，本身有荧光，需除去多余试剂,丹酰肼,与酮反应成腙,4溴甲基7甲氧基香豆素（BrMC）,与羧酸反应成酯,76,柱前衍生,在色谱分离前，预先将样品制成适当的衍生物，然后进样分离和检测柱前衍生的优点是衍生试剂，反应条件和反应时间的选择不受色谱系统的限制，衍生产物易进一步纯化，不需要附加的仪器设备。缺点是操作过程较繁琐，容易影响定量的准确性。,柱后衍生,色谱分离后，在色谱系统中加入衍生试剂及辅助反应液与色谱馏出组分直接在系统中进行反应，然后检测衍生反应的产物。柱后衍生的优点是操作简便，可连续反应以实现自动化分析。缺点是由于在色谱系统中反应，则对衍生试剂、反应时间和反应条件均有很多限制，而且还需要附加的仪器设备，如输液泵、混合室和加热器等，还会导致色谱峰展宽。,77,柱前衍生和柱后衍生两者的主要差别在：前者是根据衍生物的性质不同而进行色谱分离的，后者则先分离样品混合物，然后再衍生。究竟选用哪个，需视不同情况而定，例如，为保持较高的反应产率和重复的结果，一般要求加过量的衍生试剂，这样，有可能会干扰测定，这对采用柱后衍生的方式不太有利。若对大量样品做常规分析，则柱后衍生更适合于连续的自动化操作。有时，还可利用离子对、配位体交换和络合等反应，生成特殊的衍生产物以满足分离或检测的需要,78,柱后衍生,输送,分离,检测,进样,泵,进样阀,柱,淋洗液,显,色,剂,反,应,管,排放,加,压,Fe,3+,Cu,2+,Ni,2+,Zn,2+,Co,2+,Mn,2+,Fe,2+,Cd,2+,UV/VIS,检测,器,记录,79,五 方法的建立,1 样品的性质,2 方法的便利,3 使用者的经验,80,五 方法的建立,HPLC实验技术是一个实验性很强的操作技能，现行的各类书籍并不能包罗一切知识，实践经验非常重要。,HPLC技能是一个综合性的技能，需日积月累，厚积薄发，非一日之功。,出的来，跑的快，分的开,81,样品的性质,溶解度：在正己烷、氯仿、水或缓冲液或其他溶剂中溶解？,分子量：能否简单地用凝胶色谱分离,功能团：能否电离，酸性、碱性或中性,基质种类：血清、血浆、组织,样品在基质中的浓度：微量、痕量？,样品的可检测性：紫外可见吸收、荧光、氧化还原或衍生？与上条一起决定检测器,方法的选择性：与类似样品的分离度,82,六 生物医学应用,生物胺,氨基酸,多肽及蛋白质,糖,胆汁酸,维生素,甾体激素,83,