核酸杂交的定义

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Southern Blot,1,核酸杂交的定义,杂交（Hybridization）：如果把不同的DNA链放在同一溶液中做变性处理，或把单链DNA与RNA放在一起，只要有某些区域（当然也可以是链的大部分）有成立碱基的可能，它们之间就可形成局部的双链，这一过程称为核酸杂交。,Southern Blot: 检测DNA,Northern Blot: 检测RNA,2,Southern Blot的原理,DNA经过标准琼脂糖电泳按分子大小分离，再经原位变性，从胶上转到固相支持物上。附于膜上的DNA可以与标记的DNA，RNA或寡核苷酸探针杂交，通过特定的检测方法如放射自显影可以确定与探针互补的条带位置。,3,尼龙膜（阳性电荷）：400-500,g核酸/cm,2,变性转移液：0.4mol/L NaOH、1mol/L NaCl,水相缓冲液杂交溶液：6*SSC,预杂交液：,6SSC（或6SSPE）,5Denhardt试剂,0.,5% SDS,1,g/ml poly A,100,g/ml经变性并断裂成片段的鲑精DNA,探针,4,Southern Blot操作流程,1、将DNA转移至尼龙膜;,2、尼龙膜洗涤、固定；,3、与探针杂交；,4、成像或显色。,5,1、将DNA转移至尼龙膜,1）电泳结束后，将凝胶转移至一玻璃干燥皿，用刀片修除凝胶的无用部分，切去凝胶右下角，以便帮助在以后的操作中辨认凝胶的方位。,2）将凝胶置变性转移液（0.4mol/L NaOH、1mol/L NaCl中浸泡15分钟并不断温和地摇动例如置旋转平台上）使DNA变性，更换溶液并继续浸泡20分钟，注意缓慢地摇动之。,6,3）凝胶浸于变性转移液中的同时，按如下方法准备尼龙膜：,a用一干净解剖刀或切纸刀裁制一张长度和宽度均比凝胶约大1mm的膜。处理膜时应戴手套并用平头镊子（如Millpore镊子）操作。,b将膜漂浮于一盘去离子水的液面上直至由下而上完全湿润，然后将其浸入变性转移液中至少5分钟，用一干净的解剖刀片切去膜的一角，以便与凝胶的切角相对应。,7,4）从变性液中取出凝胶，将凝胶翻转以使其背面向上。把凝胶放于平台上湿润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。,5）用Saran包装膜或Parafilm膜围绕凝胶周边，但不是覆盖凝胶，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。并非堆放得十分整齐的纸巾，易于从凝胶的边缘垂下并与平台接触，这种液流短路现象是导致凝胶中的DNA的转移效率下降的主要原因。,8,6）在凝胶上方放置湿润的硝酸纤维素滤膜，并使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超过凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝胶之间不应留有气泡。,7）用2SSC溶液浸湿两张与凝胶同样大小的3MM滤纸，湿润的滤纸放置在湿润的硝酸纤维素滤膜上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。,9,8）切一叠（58cm高）略小于3MM滤纸的纸巾，将其放置在3MM滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃板，然后用一500g的重物压实。其目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜的上行流路，以洗脱凝胶中的变性DNA并使其聚集在硝酸纤维素滤膜上。,9）使上述DNA转移持续进行824小时，每当纸巾浸湿后，应换新的纸巾。,10,10）转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一面在上，置于一张干的3MM滤纸上，用一支极软铅笔或圆珠笔，在滤膜上标记凝胶加样孔的位置。,11,2膜的洗涤、固定,1）从膜上剥除凝胶并弃去，将膜置于0.5mol/L TrisCl（pH7.2）、1mol/L NaCl中，于室温浸泡15分钟，如此对膜进行中和并除去粘附在其上的琼脂糖。,2）将膜从中和液中提出，待拖带的多余液体流去，使膜平铺于一张纸巾上，于室温干燥30分钟以上。,12,3）从如下两种方法中任选一种，将DNA固定在膜上：,a将干燥的膜放至两张3MM滤纸之间，在真空烧箱或普通烘箱内于80烘烤0.52小时。,b将尼龙膜携带DNA的一面暴露于一紫外光源（254nm）之下。,13,3、杂交,1）配制手头实验所需的适量预杂交液。每平方厘米硝酸纤维素滤膜或尼龙膜约需预杂交液0.2ml。,2）将含有靶DNA的硝酸纤维素滤膜或尼龙膜漂浮于一盘6SSC（或6SSPE）的液面上，待其由下至上完全湿润，将滤膜浸入液体内泡2分钟。,14,3）将湿润滤膜装入可加热封接的袋中，按每平方厘米硝酸纤维素滤膜或尼龙膜0.2ml的量加入预杂交液。尽可能将袋内空气压挤出来，用加热封接机封住袋子开口的一边，将其浸入适当温度（以水为溶剂用68；以50%甲酰胺为溶剂用42）的水浴中温育12小时。,15,4）如果放射性标记的探针为双链，则于100加热5分钟使其变性，迅速在冰水浴中将探针骤冷。单链探针无须变性。,5）从水浴中取出装有滤膜的杂交袋，动作要迅速，用剪刀剪去袋的一角，向预杂交液中加入经变性的探针，然后尽可能将袋内所有空气压挤出去，用加热封接机重封袋口，尽可能减少封在袋内的气泡。为避免水浴的放射性污染，这一重新封口的杂交袋应封于另一个未污染的袋内。,16,6）将杂交袋浸入调至适当温度的水浴，按所需杂交时间进行温育。,7）戴上手套，从水浴中取出杂交袋并迅速切去一角，将杂交液倾入一个便于弃置的容器内，然后沿3个边剪开袋子，取出滤膜并随即将其置入一个盛有数百毫升2SSC和0.5% SDS的托盘内，于室温浸泡。,17,8）5分钟后，将滤膜转移至另一个盛有数百毫升2SSC和0.1% SDS托盘中，于室温温育15分钟，间或温和地摇动。,9）将滤膜转移至一个盛有数百毫升新配的0.1SSC和0.5% SDS的平底塑料盒中，于37温育30分钟至1小时，间或温和地摇动。,18,10）将溶液换为新配的0.1SSC和0.5% SDS，并将塑料盒转移到一调至68的水浴中温育同样长的一段时间。用一手提式小型探测器检测膜上的放射性活度值。滤膜上不含DNA的部分应不发出可检测的信号，在含有已同单拷贝探针杂交的哺乳动物DNA的滤膜上亦不应指望检测到信号。,11）用0.1SSC于室温短暂漂洗滤膜。将滤膜置于一叠纸巾上，以除去大部分液体。,19,4、成像或显色,1）将湿滤膜放在一张Saran包装膜上，用以放射性墨水制作的粘性圆点标签在Saran包装膜上标几个不对称的点，以便以后校准放射自显影片与滤膜的位置。用Scotch胶带覆盖标签，以免X光片夹及增感屏受到放射性墨水的污染。,2）用第二张Saran包装膜覆盖滤膜，并将滤膜对X光片曝光以获得放射自显影影像。曝光时间应根据试验来确定，不过对于哺乳动物基因组DNA的单拷贝序列，一般于-70加增感屏曝光1624小时，即可被检测出。,20,地高辛（digoxingenin，异羟基洋地黄毒苷）标记dUTP,随机引物法,缺口翻译法,光化学标记法,末端标记法,21,显色系统：,Dig-HRP DAB/H,2,O,2,（,辣根过氧化物酶 四氢氯化二氨基联苯胺/过氧化氢）,结果呈棕色。 反应稳定，价廉，但灵敏度低。,Dig-AKP BCIP/NBT（,碱性磷酸酶 5-嗅4-氯3-吲哚磷酸盐/四唑氮盐）,结果呈蓝紫色。 反应不稳定，昂贵，但灵敏度高。,22,