谷氨酸发酵机制

,*,明德崇智 厚朴笃行,*,明德崇智 厚朴笃行,明德崇智 厚朴笃行,*,第二章 谷氨酸发酵机制,第一节 谷氨酸的生物合成途径,谷氨酸的生物合成包括酵解途径,(,EMP,),、,磷酸戊糖途径,(HMP,途径,),、,三羧酸循环,(TCA,循环,),、,乙醛酸循环,、,伍德沃克曼反应,(CO,2,固定反应等,),。,1,一、生成谷氨酸的主要酶促反应,（,1,）谷氨酸脱氢酶,(GHD),所催化的还原氨基化反应,-,酮戊二酸,NH,4,+,NADPH,2,谷氨酸,H,2,O+NADP,GHD,2,这一反应是利用已存在的其他氨基酸，经过转氨酶的作用，将其它氨基酸与,-,酮戊二酸生成,L,谷氨酸。,(2),转氨酶,(AT),催化的转氨反应,COOH,C=O,CH,2,CH,2,COOH,+,COOH,CHNH,2,R,转氨酶,COOH,CHNH,2,CH,2,CH,2,COOH,+,COOH,R,C=O,酮戊二酸,氨基酸,谷氨酸,-,酮酸,3,(3),谷氨酸合成酶,(Gs),催化的反应,NADP,-,酮戊二酸,+,谷氨酰胺,GS,NADPH,2,2,谷氨酸,4,二、谷氨酸生物合成的理想途径,由葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径,5,第二节 谷氨酸生物合成的调节机制,1,、优先合成,2,、反馈调节,一、优先合成与反馈调节,二、糖代谢的调节,三、氮代谢的调节,四、其它调节,6,黄色短杆菌中，谷氨酸、天冬氨酸生物合成的调节机制,(1),、优先合成,一、优先合成与反馈调节,在菌体的代谢中，谷氨酸比天冬氨酸优先合成。谷氨酸合成过量后，谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力和阻遏柠檬合成酶的合成。使代谢转向天冬氨酸的合成；天冬氨酸合成过量后，反馈抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活力，停止草酰乙酸的合成。所以在正常情况下，谷氨酸并不积累。,7,谷氨酸脱氢酶,(GDH),的调节,谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏。,异柠檬酸脱氢酶的调节,异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢脱羧生成,-,酮戊二酸的反应和谷氨酸脱氢酶催化的,-,酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸的反应是一对氧化还原共轭反应，细胞内,-,酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡。当,-,酮戊二酸过量时对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作用，停止合成。,柠檬酸合成酶的调节,柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制。,(2),、反馈调节,8,-,酮戊二酸脱氢酶在谷氨酸产生菌中先天性地丧失或微弱。,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的调节。,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。,9,乙酰,CoA,柠檬酸,草酰乙酸,琥珀酸,-,酮戊二酸,异柠檬酸,苹果酸,乙醛酸,柠檬酸合成酶,磷酸烯醇式,丙酮酸羧化酶,丙酮酸羧化酶,丙酮酸激酶,延胡索酸,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰,CoA,葡萄糖,CO,2,Asp,谷氨酸,10,谷氨酸生产菌的育种思路,11,在菌体的代谢中，谷氨酸比天冬氨酸优先合成。谷氨酸合成过量后，谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力和阻遏柠檬合成酶的合成。使代谢转向天冬氨酸的合成；天冬氨酸合成过量后，反馈抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活力，停止草酰乙酸的合成。所以在正常情况下，谷氨酸并不积累。,12,二、糖代谢的调节,1,、能荷控制,(,细胞内的能量水平,),能量生成代谢系的调节,13,2,生物素对糖代谢的调节,(1),生物素对糖代谢速度的影响,生物素对糖代谢的影响主要是影响糖解速度。,在生物素充足条件下，由于糖降解速度显著提高，打破了糖降解速度与丙酮酸氧化速度之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸，因而会引起乳酸的溢出。,14,(2),生物素对,CO,2,固定反应的影响,由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的反应,15,由丙酮酸羧化酶催化的反应,16,先由苹果酸,酶所催化，,进行还原羧化作用，生成苹果酸,。,然后再生成,草酰乙酸,：,17,生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与,CO,2,的固定反应。据有关资树报道，生物素大过量,(100,g,L,以上,),，,CO,2,固定反应可提高,30,。,18,(3),生物素对乙醛酸循环的影响,乙醛酸循环中关键酶是异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶。,异柠檬酸裂解酶催化的反应,19,苹果酸合成酶催化的反应,20,乙醛酸循环的关键酶异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，为醋酸所诱导。以葡萄糖为原料发酵生产谷氨酸时，通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性。原因：丙酮酸氧化能力下降，醋酸的生成速度慢，所以为醋酸所诱导形成的异柠檬酸裂解酶就很少。由于该酶受琥珀酸阻遏，在生物素亚适量条件下，因琥珀酸氧化能力降低而积累的琥珀酸就会反馈抑制该酶的活性，并阻遏该酶的生成，乙醛酸循环基本上是封闭的。这样就使代谢流向,异柠檬酸,酮戊二酸,谷氨酸,的方向高效率地移动。,21,三、氮代谢的调节,控制谷氨酸发酵的另外一个,关键因素,就是,降低蛋白质的合成能力,，使合成的谷氨酸不去转化成其它氨基酸和参与蛋白质的合成。,生物素亚适量时,，几乎没有异柠檬酸裂解酶，琥珀酸氧化力弱，苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，同时又由于完全氧化降低的结果，使,ATP,形成量减少,，导致,蛋白质合成活动停滞,，在铵离子适量存在下，积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白质。,生物素充足,时，异柠檬酸裂解酶的活性增强，琥珀酸氧化力增强，丙酮酸氧化力加强，乙醛酸循环的比例增加。草酰乙酸、苹果酸脱羧反应增强，蛋白质合成增强，谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成的其它氨基酸量增加。,22,在生物素充足与缺乏条件下异柠檬酸代谢途径,生物素充足条件下,生物素缺乏条件下,23,四、其它调节,除了上述调节机制外，发现在以醋酸或石蜡为碳源时，铜离子对谷氨酸的生物合成具有调节作用。,在以醋酸为碳源，利用一种短杆菌,D,248,进行谷氨酸发酵时，添加低浓度的铜离子，可以促进谷氨酸的积累。,利用石蜡节杆菌,KY4303,菌株以石蜡为碳源，在青霉素存在下培养，则铜离子可促进海藻糖和谷氨酸的生物合成。,24,1,、谷氨酸发酵中的生物素问题, ,发酵通讯科技,第,32,卷第,1,期,2003,年,2,月,2,、谷氨酸发酵中生物素含量的测定, ,发酵通讯科技,第,32,卷第,2,期,2003,年,2,月,3,、谷氨酸的代谢控制发酵育种, ,发酵通讯科技,第,32,卷第,2,期,2003,年,2,月,张克旭,(,天津科技大学食品科学与生物工程学院,),25,谷氨酸发酵中的生物素问题,生物素用量多少，将影响到谷氨酸的产量。它的影响大体可归纳为三方面：,一、影响糖降解的速度。,二、改变发酵代谢方向。,三、控制脂肪酸生物合成,26,当培养基中,生物素,处于,过量时,，糖降解速度加快，糖至丙酮酸一段增加速度大于丙酮酸向下氧化速度，动态生物平衡被破坏。异柠酸裂解酶加强，反应沿着乙醛酸循环进行，代谢处于完全氧化型。,完全氧化型代谢,27,过量,生物素催化脂肪酸合成，进而,生成足够量磷脂,，使细胞形成比较完善的细胞膜，细胞膜渗透性差，使细胞内合成谷氨酸不能及时渗透到细胞外，,引起,谷氨酸合成过程中的,产物反馈抑制,。,限量生物素时，有利于,谷氨酸生产,并在,体外积累大量的谷氨酸,。,28,利用微生物法，通过生物素的梯度浓度，找出其与谷氨酸菌的生长量,(,即,OD,值,),，在一定范围内的线性关系，可绘制出生物素的标准曲线，待测样经稀释后，培养,12h,，从已知,OD,值曲线中找出对应的谷氨酸含量。,29,第三节 在谷氨酸发酵中怎样控制细胞膜的渗透性,在谷氨酸发酵的过程中，,关键之一在于发酵培养期间谷氨酸生产菌的细胞膜的结构与功能上的特异性变化，,使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的式样，即完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。这样，由于终产物谷氨酸不断的排出细胞外，使细胞内的谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度。,引言,30,第一、控制细胞膜的渗透性的方法,通过控制发酵培养基中的化学成分，达到控制磷脂、细胞膜的形成、或者阻碍细胞壁的正常的生物合成，使谷氨酸生产菌处于异常的生理状态，以解除细胞对谷氨酸向胞漏出的渗透屏障。,31,一、控制磷脂的合成，导致形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜,a,、生物素缺陷型,（使用生物素缺陷型菌种进行生产的时候，必须控制生物素的用量）,1,作用机制,生物素作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰辅酶,A,羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。,当磷脂合成减少到正常量的,1/2,左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。,32,2,控制的关键,为了形成有利于谷氨酸向外渗透的磷脂合成不足的细胞膜，必须亚适量控制生物素（,5,10,微克,/,升）发酵初期（,0,8,小时），菌体正常生长，菌体形态为单个、成对、八字形、棒状、椭圆，短杆形。当生物素耗尽后，在菌体的再次倍增期间，开始出现异常形态的细胞，菌体伸长、膨大乃至不规则形，边缘有褶皱。完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。,如果生物素过剩，就会出现只是长菌而不产酸的现象或者长菌好而产酸低。,33,b,添加表面活性剂（吐温,60,）或者饱和脂肪酸,使用生物素过量的糖蜜原料发酵生产谷氨酸时，通过添加表面活性剂或者高级饱和脂肪酸（,C16-18,）及其亲水聚醇酯类，同样能清除渗透屏障物，积累谷氨酸。,1,作用机制,表面活性剂和饱和脂肪酸的作用，并不是在于他的表面效果，而是在不饱和脂肪酸的合成过程中，作为抗代谢物具有抑制作用，对生物素有拮抗作用。通过拮抗生物素的生物合成，导致磷脂合成不足，结果形成磷脂不足的细胞膜。提高了细胞膜对脂肪酸的渗透性。,34,2,影响产酸的关键,必须控制好添加表面活性剂、不饱和脂肪酸的时间与浓度，必须在药剂添加之后，在这些药剂存在下，再次进行菌的分裂增值。形成处于异常生理状态的产酸型细胞，即完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。,例如：以甜菜糖蜜为原料，采用高生物素、高吐温的工艺，一般发酵对数生长期的早期（,4,6,小时），添加,0.2,吐温,60,后,OD,值与菌体重约净增一倍。剩余生长太多，意味着谷氨酸生产菌的细胞不能完成有效的进行生理学变化；剩余生长不足，意味着谷氨酸生产菌没有机会完成这种转变。,35,C.,油酸缺陷型,使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时，必须限制发酵培养基中油酸的浓度,1,、作用机制,由于油酸缺陷型突变株切断了油酸的后期合成，丧失了自身合成油酸的能力；即丧失了脂肪酸生物合成的能力，必须由外界供给油酸，才能生长。故油酸的多少，直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性。通过控制油酸，使磷脂合成量减少到正常量的,1/2,左右时，细胞变形，谷氨酸分泌积累于培养液中。,36,2,控制的关键,对油酸缺陷型突变株的谷氨酸生产力来说，最重要的因子是细胞内的油酸含量，必须控制油酸亚适量，而细胞内生物素、棕榈酸等饱和脂肪酸的含量多少却影响甚微。若,油酸过量时，只长菌不产酸，或者长菌好而产酸低,，只有在油酸亚适量的情况下，当油酸耗尽之后，谷氨酸菌经再度倍增，发生细胞膜结构与功能上的特异性变化，除去谷氨酸向膜外渗透的障碍物，谷氨酸才能高产。,37,d,甘油缺陷型,使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵时，必须限制发酵培养基终甘油的浓度,1,作用机制,甘油缺陷型的菌株丧失,-,磷酸甘油脱氢酶，即丧失,L,-,甘油,3,磷酸,NADP,氧化还原酶。所以必能合成,-,磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜中与渗透性直接关系的磷脂含量，使谷氨酸得以积累。,38,2,控制的关键,使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵的生产时，为了高产谷氨酸，必须控制添加亚适量的甘油或甘油衍生物。这样，不管是用醋酸,还是糖质原料，不管添加还是不添加生物素、油酸、硫氨素等物质，都能高产谷氨酸。这是由甘油缺陷型所控制的位置决定的。细胞内的磷脂可以由添加甘油的数量来调节，添加甘油过少，菌株生长不好，数量不够，周期长。,甘油过量，,磷脂合成正常，只长菌不产酸，或者长菌好产酸低；,只有亚适量的控制甘油,的时候，开始菌体正常生长，当甘油耗尽后，通过再度增殖，细胞变形。细胞磷脂的含量变为亲株的一半。压榨细胞的体积变小，从而破坏了细胞膜对谷氨酸的渗透屏障，使谷氨酸向膜外渗漏。,39,二、阻碍谷氨酸菌细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，进而导致形成不完全的细胞膜,例如，在发酵对数生长期的早期，添加青霉素或者头胞霉素,C,等抗生素,1,、作用机制,添加青霉素是抑制谷氨酸生产菌细胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽转移酶，影响细胞壁糖肽的合成。,40,2,、影响产酸的关键,在生长的什么阶段添加青霉素是影响产酸的关键。,必须要在增殖过程的适当时期添加，开始进入对数生长期的早期（,3-6,小时）添加，添加青霉素的时间与浓度，因菌种、接种量、培养基的组成以及发酵条件的不同而不同。加入青霉素后，在菌体倍增期间，使新增殖的细胞没有充足的细胞壁合成，菌体形态急剧变化。多呈现伸张，膨润的菌型。完成由非积累型谷氨酸向积累型谷氨酸的转变。,41,第,二、物理控制方法,利用温度敏感型细胞进行谷氨酸发酵时，由于仅仅控制温度就能实现谷氨酸的生产，所以我们把这种新工艺称为物理控制方法。,1,、突变位置,这些突变株的突变位置是发生在决定与谷氨酸分泌有密切联系的细胞膜的结构基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱基所置换，这样为碱基所指导译出的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变。,42,（,2,）影响产酸的关键,利用温度敏感型突变株进行谷氨酸发酵时，在生长的什么阶段转化温度是影响产酸的关键。必须要控制好温度转换的时间。（由,30,度提高到,40,度的时间,),并且要在温度转换之后，进行适度的剩余生长，温度转换的最适时间，因菌株、接种量、培养基组成和发酵条件而异。,以甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜为原料生产时，一般在,A,562,为,0.3-0.5,范围内转换温度为宜。转换时间不同，产酸显著变化。在温度转移之后，必须要进行适度的剩余生长，完成从谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞转变。剩余生长太多，意味着细胞未能进行有效的生理学变化，剩余生长太少，意味着细胞没有机会完成这种转变。,43,第三、强制控制工艺的要点和实例,为了稳定产酸，克服因发酵培养基中某些营养不易控制（如生物素的含量）所造成的影响，在谷氨酸发酵中，也可以采取“高生物素、高青霉素”、“高生物素、高吐温”的办法。,44,采用强制工艺，生产谷氨酸时，影响产酸的关键是：,添加青霉素或头胞霉素,添加表面活性剂,添加饱和脂肪酸,转换温度（,30,40,度）,在生长的什么阶段,是影响产酸的关键,45,添加青霉素或头胞霉素,添加表面活性剂,添加饱和脂肪酸,转换温度（,30,40,度）,必须控制好,的时间与浓度,46,药剂添加后,转换温度后,必须在,再次进行适度的增殖,完成谷氨酸非积累型细胞向积累型细胞的转变，（细胞伸长、膨大等变形,),，,此转移期间是非常必要的。,47,青霉素或头胞霉素,表面活性剂,饱和脂肪酸,添加,的时间与浓度，或转换温度的时间,随着菌株、接种量、培养基以及发酵条件的不同而不同。,48,乙醛酸循环,(glyoxylate cycle ),存在于微生物和植物,以乙酸为碳源，并作为能源来利用时所进行的代谢途径。,也是种子在靠贮藏脂肪发芽时，,把脂肪酸分解成乙酰辅酶,A,的循环代谢过程。,49,50,51,52,本章复习题,1,、谷氨酸的生物合成途径包括那些？,2,、生成谷氨酸的主要酶促反应分为哪三种？,3,、谷氨酸的生物合成途径的理想途径？,4,、试述谷氨酸生物合成的调节机制？,5,、试述在谷氨酸发酵中怎样控制细胞膜的渗透性？,6,、在以葡萄糖为原料生产谷氨酸时，检测不到异柠檬酸裂解酶的活性，为什么？,7,、谷氨酸发酵强制控制工艺的优点和缺点分别是什么？,53,