微生物限度检查及控制_王旭

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Page,30,微生物限度检验及控制,2009,教程目的,GMP,检查中常见的缺陷,微生物限度检查的定义,微生物限度检查的样品处理,微生物限度检查用培养基及其灵敏度检查,微生物限度检查方法和验证,1,GMP,检查中常见的缺陷,XXX,止咳糖浆中含有防腐剂，但成品的微生物限度检验操作规程未严格按照,2000,年版,中国药典,的要求制定，未考虑到防腐剂对试验的影响，检验方法不合理。,纯化水微生物限度检测方法未验证，实际检测方法不合理，样品被稀释了,1660,倍后再用直接接种法进行检测。,微生物限度检查的原始记录缺少所用培养基的名称、配制批号。,注射用水、纯化水检测中，未按,2005,版药典要求进行霉菌和酵母菌数的检验。,2.,定义,测定所有药用材料（从原料到成品）中需氧微生物的数量的方法。,证明所有药用材料（从原料到成品）中无特定微生物的方法。,3,.,取样及样品处理,我们期望什么,?,在整批产品中特定微生物的数量,。,我们做的是什么测试,?,限度是一个破坏性的实验,我们不能对整批进行,100%,检验。,如何通过检验来证明整批产品的微生物数量？,要求有一个取样计划来涵盖整个批号。,有足够的取样量和检验量,无抑菌因素,如何对批进行取样？,样品必须具有批代表性：,最易污染的位置取样：,批开始、结束及重大故障和调整后,连续性,随机性,上述取样过程要有文件规定和记录,3,.,1,取样及样品处理,_,取样计划,取多少样 （检验数量）,?,药典规定检定量是：,10,克或,10,毫升,同时要考虑检验损耗和复试,3,.,2,取样及样品处理,_,取样量,目的,溶解：避免读数时的干扰,匀质：保证检验量,消除抑菌因素：提高检验灵敏度,3,.,3,取样及样品处理,_,供试液的制备,方法,:,10ml/g,样品，加无菌氯化钠蛋白胨至,100ml, 1,小时内使用,3,.,3,取样及样品处理,_,供试液的制备,无抑菌性水溶性液体样品：,无需处理,无抑菌性油性液体样品：,加聚山梨酯,20,、,80;,乳浊液（,45,70%,。,药典无要求,检查频率：每次灭菌批（至少灭菌参数变更后,4,.,3,微生物限度检查用培养基,_,保存,应规定保存有效期,:,在密闭容器中一年，非密闭容器中一月,2-25,保存,确保,pH,在密闭容器中保存,使用三种微生物培养基,有效控制微生物培养基的保存和效期,4,.,4,微生物限度检查用培养基,_,结论,5.,微生物限度检查,方法,药典规定两种方法:,平皿法,:,加,1ml,样品制备液至无菌平皿中，倒,15-20ml, 45,培养基混匀倒置培养,。,至少制备,2,个平板。,控制菌落数在,30-100CFU,（细菌），,30-80CFU,（真菌）,薄膜过滤法,：,制备液用,0.45,m,膜过滤并用,3x100ml,无菌蛋白胨水淋洗后，菌面朝上贴与培养基上。,每种培养基制备一张膜,控制菌落数,100CFU /,膜,若样品本身的混浊，会干扰计数结果,要考虑对样品中抑菌因素进行中和,0.5,大豆磷脂,4,聚山梨醇酯,由于接种量限制，试验灵敏度受局限,操作简便，设备要求低,5.1,微生物限度检查,方法,_,平皿法,操作复杂，设备要求高,不适用于无法溶解的样品,大体积检验量，检验灵敏度不受局限,样品中的抑菌因素可被滤除,中和试剂可应用在淋洗液中，如：,-,内酰胺酶,分散剂可作为溶剂，如十四烷酸异丙酯,5.2,微生物限度检查,方法,_,薄膜过滤法,两种方法的共同点,:,-,培养基和培养温度,-,培养时间,-,工作环境：,100级区域进行,（一般是要求与生产的洁净条件一致）,5,.,3,微生物限度检查,方法,TSB,培养基中增菌培养,2,天,金葡菌：,划线甘露醇氯化钠琼脂,30,35,，培养,1,天。革兰氏染色显微观察。,无阳性球菌,大肠、沙门和绿脓：,划线麦康凯琼脂,30,35,，培养,1,天，革兰氏染色显微观察。,无阴性杆菌,控制菌检查,:,5,.,4,微生物限度检查,方法,方法验证试验,_,证明在试验条件下没有抑菌作用，如：防腐剂，抗生素，中和剂，表面活性剂，,下列情况应进行重新验证：,检验方法变更,培养基变更（包括，灭菌参数变更）,产品处方变更,菌种,：大肠、金葡、枯草、白念、黑曲霉、控制菌,5,.,5,微生物限度检查,方法,_,方法验证,方法验证试验,_,证明在试验条件下没有抑菌作用，如：防腐剂，抗生素，中和剂，表面活性剂，,下列情况应进行重新验证：,检验方法变更,培养基变更（包括，灭菌参数变更）,产品处方变更,挑战菌液,：,大肠、金葡、枯草，稀释至,50-100cfu/ml,待用,白念、黑曲霉，稀释至,30-80,cfu/ml,待用,5,.,5,微生物限度检查,方法,_,方法验证,验证方法：,试验组：挑战菌液样品制备后进行试验,供试品对照组：样品制备后进行试验,菌液组：挑战菌液进行试验,空白对照组：直接用稀释液进行试验,5,.,5,微生物限度检查,方法,_,方法验证,验证合格标准,细菌、霉菌及酵母菌计数试验,空白对照组无菌生长,菌液组无杂菌生长,（试验组供试品对照组）,菌液组,70,控制菌检查试验,空白对照组无菌生长,菌液组无杂菌生长,对试验组的菌落鉴定，确认是所接种挑战菌株,5,.,5,微生物限度检查,方法,_,方法验证,报告：（平均计数,稀释倍数）,若在,1:10,稀释样品中没有检出，报告,10cfu/g(ml),若平均值有小数，应取整数后乘稀释倍数，例如：,1:10,稀释样品：,平板,1: 1cfu;,平板,2,：,0cfu;,平均为,0.5,报告结果是,10cfu/ml,而不是,5cfu/ml,5,.,6,微生物限度检查,方法,_,结果判断,结论:,有三种检验方法，但所用培养基、培养温度、时间相同,检验方法应验证证明，在试验条件下没有抑菌效应,5,.,7,微生物限度检查,方法,_,结论,培养基:,细菌,:,大豆胰蛋白琼脂，,30,-,35,，培养,48,小时,霉菌酵母：沙氏葡萄糖，,20,-,25,，培养,5,天,6,.,微生物限度检查,_,USP,介绍,美国药典：,多管法,6,.,微生物限度检查,_,USP,介绍,中国药典中对控制菌检查有类似方法,要考虑对样品中抑菌因素进行中和,0.5,大豆磷脂,4,聚山梨醇酯,由于接种量限制，试验灵敏度受局限,操作复杂，设备要求高,适用于无法溶解的样品,6,.,微生物限度检查,_,USP,介绍,美国药典：,多管法,6.,无菌检验,USP 2,9,Ph.eur,supplement,6th,2.6.1,3,中国药典 附录,X,I,J,JP XV SECTION,35,BP 2002 Appendix XV,I B,TGA guidelines 200,4 App17,ISO 14730.2,参考资料,谢谢您的出席,王旭,电话：50801010-5941,