免疫学技术在食品科学中应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,免疫学技术在食品科学中应用,讨 论 课,免疫学理论（或免疫学技术）在,食品科学中的应用,1,、研究背景,2,、研究目的,3,、实验方法,4,、结果与分析,5,、结论,PPT,内容,第八章,免疫学检测技术,免疫学检测技术以其灵敏度高、专一性,强和速度快等显著特点广泛用于食品的品,质、质量、安全以及食品中生物活性成分的,检测与分析。,第一节,抗原抗体的检测,一,.,抗原抗体反应,指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合,反应，是免疫球蛋白分子上的抗原结合位和抗,原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子,间的引力参与下发生的反应。抗原抗体反应可,发生于体内，也可发生于体外。,抗原,抗体,抗原与抗体之间通过非共价键结合，它们之间的结合力包括,电荷引力,、,范德华力,、,氢键结合力,和,疏水作用力,。多种非共价结合力使抗原抗体紧密结合在一起。,抗原与抗体结合力,抗原与抗体反应特点,抗原,抗体,1,、特异性：抗原抗体在化学结,构和空间构型上呈互补关系，,两者结合具有高度特异性。,2,、按比性：两者分子比例合适,时才出现最强的反应。,3,、可逆性：改变,pH,和离子强度,是最常用的促解离方法。,抗原与抗体反应的影响因素,1）抗原抗体性质,：互补程度,2）酸碱度,：,pH 6-8,温度,：,37,度,电解质,：,0.85%,氯化钠或各种缓冲液,二,.,利用抗原抗体反应的实验,主要用途：,用已知的抗原检测未知的抗体。,用已知的抗体检测未知的抗原。,定性或定量检测体内各种大分子，如：细胞因子，免疫球蛋白。,二,.,利用抗原抗体反应的实验,免疫凝集试验,免疫沉淀反应,免疫标记技术,其他,1.,免疫凝集试验,颗粒抗原,(,例；细菌、红细胞）或可溶性抗原结,合于不容性载体微粒上后与相应的抗体在适当的,条件下，经一定时间后凝集成肉眼可见的凝集物。,直接凝集反应,间接凝集反应,免疫凝集反应,颗粒抗原,相应抗体,直接凝集反应,颗粒抗原,(,例；细菌、红细胞）与相应的抗体直接结,合所出现的凝集现象称为直接凝集反应。,直接凝集反应,肉眼可见的凝集物,直接凝集试验,试管法,玻片法,将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关,的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应的抗,体,(,或抗原,),作用，在有电解质存在的适宜条件下，即,可发生凝集，称为间接凝集反应。,载体：人或动物的红细胞、活性碳颗粒、聚苯乙烯胶,乳等。,载体增大抗原（或抗体）反应面积。,间接凝集反应,可溶性抗原,不容性载体,相应抗体,正向间接凝集反应,可溶性抗体,不容性载体,可溶性相应抗原,反向间接凝集反应,待测标本,相应抗体,致敏抗原,凝集,不凝集,间接凝集抑制反应,可溶性抗体,SPA,相应抗原,协同凝集反应,常用于食品安全检测，如：食物中微生物志贺氏,菌污染检测。,具体方法：,SPA,（,Staphylococcal Protein A,金黄色葡,萄球菌细胞壁的一种蛋白质成分）具有同人和多种哺,乳动物,IgG,分子,Fc,段结合的能力。结合到,SPA,上的志贺,氏菌抗体与志贺氏菌产生特异性的凝集反应，产生可,见的凝集反应，从而用于快速检测。,免疫凝集试验应用,2.,免疫沉淀反应,免疫沉淀反应（,precipitation,）是指可溶性抗原,（细菌培养液、细胞或组织浸出液、血清蛋白等）,与相应抗体特异结合后，在电解质参与下出现的沉,淀现象。该反应多用于半固体琼脂作为介质，抗原,抗体在凝胶中扩散，在比例合适处形成白色沉淀。,单向免疫扩散,单向免疫扩散（,single immunodiffusion),将一定量的已知抗体均匀混于琼脂凝胶中,制成琼脂板，在适当位置打孔后加入抗,原。孔内抗原向四周呈环状形成浓度梯,度，在抗原与抗体的量达到一定比例时即,可形成肉眼可见的沉淀环。,抗原,抗体,双向免疫扩散,双向琼脂扩散（,double immunodiffuse test),可溶性,抗原和抗体在含有电解质的同一个琼脂凝胶板的对应,孔中，各自向四周凝胶中扩散，如果两者相对应，则,发生特异性反应，在浓度比例合适处形成肉眼可见的,白色沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性检测、组,成和两种抗原的相关性分析。,将抗原样品先进行电泳，使其中的各种成分彼此,分开，然后加入抗体做双向免疫扩散，以分离的各,抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例,适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。,免疫电泳,常用于食品安全检测，对食品中污染,病源菌的定性和监别，以及食品中的,某些成分。,如：,单向免疫扩散法检测牛乳中免疫,球蛋白含量。,免疫沉淀试验应用,3.,免疫标记技术,免疫标记技术,immunolabelling technique,指用荧光素，放射性核素，酶、化学发光剂,等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原,抗体反应。具有灵敏度和特异性高，快速，,可定性、定量等检测。,免疫标记技术分类,酶标记免疫学分析,EIA,放射线标记免疫学分析,RIA,免疫荧光法,IF,酶标记免疫学技术,将酶催化作用的高效性与抗原抗体的特异性相结,合的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体后形成的,酶标记物，既保留抗原或抗体的免疫活性，又保留了,酶的催化活性。当酶标记物与待测标本中相应的抗原,或抗体相互作用时，可形成酶标记抗原抗体复合物。,利用复合物上标记的酶催化底物显色，其颜色的深浅,与待测标本中抗原或抗体的量相关。,灵敏度：,ng-pg,常用酶,:,辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶,酶标记免疫学技术,酶联免疫吸附试验（,e,nzyme,l,inked,i,mmuno,s,orbent,a,ssay, ELISA,),免疫印迹技术,(,Immuno,-blotting),酶免疫组化技术,（,enzyme,immunohistochemistry,technique),其它,ELISA :,enzyme linked immunosorbent assay,将已知抗体,（,抗原,）,包被于载体上，再加上抗,原,-,抗体反应使酶标记抗体,（,抗原,）,结合在载体上，,经洗涤去除游离的酶标记抗体,（,抗原,）,后加入底,物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物,的存在与含量的检测技术。,酶联免疫吸附试验（,ELISA),酶联免疫吸附试验（,ELISA),间接法,双抗体夹心法,竞争法,酶联免疫吸附试验（,ELISA),间接法,抗原,抗体一抗,二抗,底物,产物,酶联免疫吸附试验（,ELISA),双抗体夹心法,（三明治,),抗原,抗体,酶标抗体,底物,产物,酶联免疫吸附试验（,ELISA),竞争法,E,E,E,E,E,E,E,E,E,E,E,E,测定,对照,抗原,底物,产物,抗体,E,酶标抗原,ELISA,广泛应用于食品科学领域。,食品中农药残留检测,食品中抗生素残留检测,食源性病原菌检测,食品安全检测,食品成分提取,功能性食品研究,免疫印迹技术,(Immuno-blotting),将凝胶电泳的高分辨力同固相免疫测定结,合起来的一种方法。先将复合物在分离胶中分,离，然后将这些分子转移至膜上，再用特异性,的抗体来鉴定这些单个的抗原成分。,免疫印迹技术,(Immuno-blotting),SDS-PAGE,蛋白质转印,酶免疫测定,可应用于蛋白质提取及分析等许多方面。,三项技术结合而成。,免疫印迹技术,(Immuno-blotting),CBB,Immunoblotting,LWPC,LWPC,酶免疫组化技术,以酶标抗体与组织或细胞的抗原进行反,应，结合形态学检查，对抗原进行定性、,定量或定位检测的技术。,用于测定组织或细胞表面的抗原。,3.,免疫标记技术,酶标记免疫学分析,EIA,放射线标记免疫学分析,RIA,免疫荧光法,IF,放射线标记免疫学分析,RIA,用放射性同位素标记抗原或抗体进行免疫,学检测的免疫标记技术。该法灵敏度高达,pg,。,常用的放射性同位素有,125I,和,131I,。,应用于食品安全检测，食品中农药残留、,激素等检测。,免疫荧光法,IF,直接法,荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。,特异性强，但任一抗原均需制备荧光素抗体,间接法,用第一抗体与标本中抗原结合，再用荧光素,标记的二抗进行检测。灵敏度高、荧光素标记的二抗,可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光增多。,第二节,淋巴细胞的测定,测定淋巴细胞的功能，可以判断机体的细,胞免疫或体液免疫水平。,测定淋巴细胞功能试验应用于功能性食品,等研究中。,T,淋巴细胞增殖试验,T,细胞功能测定,细胞毒试验,T,淋巴细胞增殖试验,T,淋巴细胞在有丝分裂原或抗原刺激下可转化,为淋巴母细胞，产生一系列形态变化。细胞变,大、细胞浆增多、出现空泡、核仁明显、核染色,质疏松等。,T,淋巴细胞增殖试验,形态学方法,-,镜检淋巴母细胞,3,H-TdR,掺入法,氚标记胸腺嘧啶核苷（,Thymidine ribosode),渗入法。测定,DNA,增殖的量,(,也可用于测,NK,细胞活性,),MTT,比色法,细胞活化增殖水平,（,可溶性噻唑盐，代谢后产生兰紫色物,）,T,淋巴细胞增殖试验,T,淋巴细胞增殖试验,根据形态结构，计算淋巴细胞转,化率，即淋巴母细胞的含量,形态学方法,淋巴细胞转化过程中，细胞,DNA,合成大,量增多。在细胞培养液中加入氚标记的胸,腺嘧啶核苷（,3H-TdR,），使,3H-TdR,渗,入到,DNA,中，根据细胞内核素的量可判断,淋巴细胞转化程度。,3H-TdR,掺入法,MTT,比色法,MTT,是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细,胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量,代谢过程，,MTT,代谢形成蓝紫色甲瓒沉积,于细胞内或细胞周围，形成的甲瓒的量与,细胞活化增殖的程度成正相关。,细胞毒试验,细胞毒试验,乳酸脱氢酶法,细胞凋亡检查法,乳酸脱氢酶法,LDH,在胞浆内含量丰,富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受,损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细,胞培养液中,LDH,活性与细胞死亡的数目,成正比，用比色法测定。,乳酸脱氢酶法,细胞凋亡检查法,靶细胞被,CTL,杀伤后，可发生细胞凋亡。方法有形,态学法、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞,仪等。,细胞凋亡检查法,B,细胞功能测定,B,细胞的数目和功能测定是反应机体体液,免疫水平的重要指标。,抗体形成细胞试验,用绵羊红细胞（,SRBC,）免疫家兔或小鼠，取,家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与高浓度,的,SRBC,混合后加入琼脂糖凝胶中，其中每个释,放溶血性抗体的细胞可致敏其周围的,SRBC,，在,补体参与下，抗体形成细胞周围,SRBC,溶解，在,其周围形成一个肉眼可见的空斑。一个空斑代表,一个抗体形成细胞，空斑数量反应机体的体液免,疫功能。,举 例,增强免疫力的功能性食品的研究,1.,乳果糖低聚体促进肠粘膜,IgA,的分泌,2.,具有促进,IgA,产生的食用蘑菇的探索,、,b,-LG,增强淋巴细胞产生抗体,促进,IL4,的产生,5.,b,-LG,促进,IFN,的产生,6.,大豆胰蛋白酶抑制剂增强脾淋巴细胞产生,IgM,7.,调节肠,Caco-2,细胞产生,IL-8,的食品成分的研究,结果；薄荷抽提物具有促进,IL-8,分泌的作用。,降低过敏性的食品研究,1,.,具有抗过敏性的乳酸菌株的选拔,2.,具有抗过敏性的甜茶成分的分析,3.,降低卵白蛋白刺激引起的,IgE,抗体水平的乳酸菌株的研究,谢谢！,