实验五多抗制备4+免疫比浊

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,沉淀反应,1,本次实验内容,实验一、双向免疫扩散试验,LDL,多抗鉴定及效价测定,实验二、免疫浊度测定,免疫球蛋白检测,2,一、本次实验的目的：,1,、掌握可溶性抗原制备抗血清鉴定的常用方法。,2,、掌握双向免疫扩散试验方法。,3,、掌握抗体效价的判断。,4,、掌握免疫浊度的测定原理。,5,、熟悉免疫球蛋白检测的临床意义。,3,沉淀反应,（,precipitation,）,可溶性抗原,与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的,沉淀现象,。,4,分类,液体内沉淀试验,絮状沉淀试验,环状沉淀试验,免疫浊度测定,凝胶内沉淀试验,免疫扩散,免疫电泳,单向免疫扩散试验,双向免疫扩散试验,火箭免疫电泳,对流免疫电泳,沉淀反应,5,思考：抗原抗体反应的四大特点？,特异性 可逆性,比例性 阶段性,6,沉淀反应的特点,抗原为,可溶性,物质，如蛋白质、多糖,沉淀反应分两个阶段：,第一阶段、抗原抗体特异性结合,(,不可见,),第二阶段、形成可见的免疫复合物（可见）,条件,电解质，温度，酸碱度,7,凝胶内沉淀试验,(gel phase precipitation),主要是指,琼脂糖扩散,或称,凝胶扩散,(gel diffusion),。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。,8,根据实验目的与方法不同，可将固相内沉淀验分为,2,类：,（一）免疫扩散,单向,免疫扩散试验,(single gel diffusion test),双向,免疫扩散试验,(double gel diffusion test),（二）凝胶免疫,电泳,(gel immuno-electrophoresis),火箭免疫电泳,双扩散免疫电泳,9,一、单向免疫扩散试验,(,一,),原理,将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。,10,(,二,),操作步骤,（平板法）,1.,将,抗体,和,0.9%,琼脂糖,50-56,混合,即刻倾注成平板。,2.,待凝固后在琼脂板上打孔,孔中加入,已稀释的抗原溶液,和不同浓度的,抗原标准品溶液,。,3.,置,37,让其向四周自由扩散,24-48h,后可见其孔周围出现沉淀环。,11,单向辐射状免疫扩散,上排为,5,个不同的参考，中、下排为患者血清，下排右,2,为一异常病理血清,12,(,三,),方法评价,单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为,1.25mg/L,13,(,四,),影响因素,1.,抗原分子量,抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。,2.,抗体种类,实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原,0.11IU/ml,，马抗血清为,110IU/ml,，羊为,0.44IU/ml,，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。,14,3.,抗体稀释度,抗体浓度大，沉淀环小，则敏感度低；抗体浓度小，沉淀环增大，不同浓度抗原间的差别较显著，敏感度高。但沉淀环过大，常造成边缘糊不清，致使测量误差也增大。因此,要求在沉淀环清晰的基础上加大稀释度以提高敏感度,。,15,二、双向琼脂扩散试验,(,一,),原理,将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的,浓度、纯度和扩散速率,等有关。,16,(,二,),操作步骤,（平板法）,融化琼脂，浇板,每张载玻片约,4ml,。,凝固，打孔,孔径,3mm,，孔间距,35mm,，孔型有,双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。,加样,在相对孔内加抗原或抗体。,孵育,使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的纯度、浓度和扩散速度有关。,17,18,(,三,),双向免疫扩散试验的应用,1.,检测未知抗原或抗体及其相对含量,将已知的抗体或抗原与待检标本加入,成对孔中,根据沉淀线有无,定性,；,根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的,相对含量,根据沉淀弧形状判断抗原或抗体的,相对扩散速率。,19,沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系,A,：,Ag,、,Ab,浓度及扩散率近似；,B,：,Ag,、,Ab,浓度近似，扩散率,Ag,Ab,；,C,：,Ag,、,Ab,浓度近似，扩散率,Ag,Ab,；,D,：扩散率近似，浓度,Ag,Ab,；,E,：浓度,Ag,Ab,，扩散率,Ag,Ab,；,F,：浓度,Ag,Ab,，扩散率,Ag,Ab,20,2.,抗原性质分析,利用,三角孔型,，将待检抗原和标准抗原加入相邻两个孔中，与另一孔相对，根据沉淀线形状分析待测抗原，见图 。,21,三种扩散基本图型,22,3.,抗体效价滴定,用,梅花型,孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的效价。,23,效价检测结果,该图是经过一次基础免疫，三次加强免疫，间隔七天之后，颈动脉取血所得血清测定的效价。,免疫双扩散测效价，加样方式同上，从图中可以看出最后测得的效价分别为：,1,：,256,，,1,：,128,，,1,：,128,中间孔,抗原； 周围孔,血清,血清的稀释倍数分别为：,孔,1,1/8,；,孔,2,1/16,；,孔,3,1/32,；,孔,4,1/64,；,孔,5,1/128,；,孔,6,1/256,6,5,4,3,2,1,24,4.,抗体或抗原纯度鉴定,用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯，出现多条说明不纯。,25,双扩散试验优缺点,优点：简单易行，用途广泛,缺点：技术灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量。,26,经典的沉淀试验有,4,个缺点无法克服：,操作繁琐,敏感度低（,10,100g/ml,）,时间长,难以自动化,27,免疫浊度测定,（一）基本原理：,免疫浊度测定的基本原理是：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。,当,反应液中保持,抗体过量且固定,时，形成的,复合物随抗原量增加而增加,，反应液的,浊度亦,随之,增加,，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含量。,28,（二）类型,透射免疫比浊法,散射免疫比浊法,免疫胶乳比浊法,29,1,透射免疫比浊法,原理：,抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物,(IC),，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复合物粒子对光线的,反射和吸收,，引起透射光减少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线吸收越多，可用吸光度表示。,吸光度和复合物的量成正比,，当抗体量固定时，与待检抗原量成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出待检抗原含量。,30,方法评价：,优点：,灵敏度比单扩法高,5,10,倍；,CV,小于,10,；,操作简便快速，,1h,可报告结果；,结果准确，且能用全自动化或半全自动化仪器进行分析，尤其随着胶乳粒子增强浊度测定法的出现，使敏感度提高，其应用更加广泛。,缺点：,抗体用量较大；,检测需抗原抗体反应达到平衡，耗时较长；,不宜用于药物等半抗原的测定；,灵敏度较散射比浊法低。,31,2,散射免疫比浊法,原理：,散射光,系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，,散射光的强度与复合物的含量呈正比，,即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为,速率散射比浊法,(rate nephelometry),和,终点散射比浊法,(endpoint nephelometry),。,32,3,免疫胶乳比浊法,原理,选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。,33,（,a,）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线；,（,b,）结合后，则形成光线衰减,34,方法评价,敏感度高，试剂稳定，因反应液中无,PEG,沉淀剂的影响，个体,IC,对结果影响也小，所以结果稳定、可靠，特异性好；不需特殊仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。,35,总评价,缺点：,测定结果与仪器的性能和试剂的质量密切相关，特别对抗体的质量要求高，仪器和试剂价格比较贵。,优点：,自动化,快速,(30,60s),灵敏,(g/L),准确,精密度高,(CV5,),稳定性好,节省试剂,检测范围广,不需减去样本和试剂本底值等优点。,36,(,三,),免疫比浊法主要影响因素,抗原抗体比例,抗体的质量,抗原抗体反应的溶液,增浊剂的使用,37,1,抗原抗体比例,高剂量钩状效应（,high dose hook effect ),海德堡（,heidelberger,）曲线理论,38,39,2,抗体的质量,（,1,）特异性高,（,2,）效价高,（,3,）亲和力高,（,4,）抗血清来源,40,3,抗原抗体反应的溶液,pH,6.58.5,电解质,离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）,41,4,增浊剂的使用,PEG,、,tween-20,等非离子型亲水剂,作用：消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。,42,本次实验内容,实验一、双向免疫扩散试验,LDL,多抗鉴定及效价测定,实验二、免疫浊度测定,免疫球蛋白检测,43,血清的采集与处理,取血方法,：,血清的采集：耳缘静脉取血或颈动脉取血。,血清处理：,取好血后，放入,37,，,30min,后，使血清充分析出（不能冰冻，否则产生溶血），经,3000rpm/5min,分离血清,，,剩余放进,-20,冰箱保存。,实验一、双向免疫扩散试验,LDL,多抗鉴定及效价测定,44,实验二、免疫浊度测定,免疫球蛋白检测,实验步骤见说明书,IgG13g/L,IgA2.62g/L,IgM1.1g/L,45,