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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,血清醋酸纤维素薄膜电泳,实验三,电泳技术,分光光度技术,层析技术,离心技术,生物化学的四大研究技术,：,电 泳 技 术,带电粒子在电场中移动的现象称为,电泳,。,电泳技术,即是利用样品中各种带电粒子的带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品分子进行分离、鉴定、纯化和制备。,在生物医学领域，该技术多用于分离，纯化、鉴定蛋白质、核酸等大分子物质。,Kaurin Tiselius (1902-1971)因研究电泳和吸附分析，特别是发现关于血清蛋白的复杂本质而获奖1948诺贝尔生理医学奖。,1809年，俄国物理学家Pece首次发现电泳现象；,1937年，Kaurin Tiselius 发明了Tiselius电泳仪，建立了自由界面电泳，首次证明人血清蛋白的组分；,1948年，Wieland和Fischer以滤纸作为支持介质的电泳；,1959年，Raymond和Weintraub利用人工合成凝胶作为介质聚丙烯酰胺凝胶电泳:生物大分子的“Last Check”！,（） （+）,-表面带负电荷,+ 带正电荷的水层,（） （ + ）,+ 表面带正电荷,- 带负电荷的水层,+,+,电泳的影响因素：,1、,影响电泳迁移率的外界因素：,电场强度,溶液的pH值,溶液的离子强度,电渗现象,2.影响电泳迁移率的内在因素：,质点所带净电荷的量,质点的大小和形状,电泳的分类,根据电泳中是否使用支持介质分为：,自由界面电泳,区带电泳,根据电泳系统pH是否连续分为：,连续pH电泳,不连续pH电泳,按支持物的装置形式不同,分为：,水平板式电泳,垂直板式电泳 垂直柱式电泳,根据电泳物质类别不同分为：,细胞电泳，核酸电泳，,蛋白质电泳,等,按其介质的物理性状不同可分为：,凝胶电泳 粉末电泳 线丝电泳,纤维膜电泳,等,血清醋酸纤维素薄膜电泳,基 本 原 理,本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。,血清中含有清蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同。,以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带。其中清蛋白的泳动速度最快，其余依次为1-、2-、-及-球蛋白。,试剂,巴比妥缓冲液，染色液，漂洗液,材料,血清，醋酸纤维素薄膜,器材,电泳仪，培养皿，点样器，玻璃板,粗滤纸，铅笔，加样枪，镊子等。,试剂和耗材,操作步骤,1. 准备,醋酸纤维素薄膜的预处理：,将薄膜小心放入盛有缓冲液的培养皿内，使其漂浮在液面；用镊子轻压，使其全部浸入缓冲液内。待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出,光滑面,和,粗糙面。,标记：,在,粗糙面,上用铅笔距薄膜条一端,1.5cm,处划线即为点样线并作好标记。,2. 点样（关键）,在薄膜的,粗糙面点样,。点样时，先用吸管将3微升血清,均匀,地涂在点样器表面，再用点样器“印”在薄膜的点样区内，样品呈线状，宽约12mm。,注意：,点样时动作要,轻,、,稳,，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果 。,另外操作过程要防止指纹污染。,3. 电泳,将点样后的薄膜使,粗糙面（点样面）向下,，,点样端置于负极,，贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，平衡5min。,打开电源，调节电压和电流强度。调节电压至90-100V左右，电流强度为0.40.6mA/cm薄膜条宽，电泳时间40min-1h左右。,1.滤纸桥 2.电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架 5.电极室中央隔板,点样端,4.,染色,电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。,5. 漂洗,用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每3-5min左右换一次液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。,操作中，注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。,分清薄膜的点样面,注意点样样品的宽度和力度,注意薄膜放置的方向,控制染色及漂洗时间,保持良好的实验秩序,6、注 意 事 项,预期结果,一般的染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白和球蛋白。,清蛋白,1,2, ,1、洗脱法：,剪下各蛋白区带,0.02mol/L NaOH洗脱,将洗脱液用分光光度计比色,结果计算,每种蛋白质占总蛋白质量的相对含量,=,该种蛋白管光密度读数,各管光密度读数之和,100%,思考： 如何设置洗脱法 的空白对照？,各蛋白组分的定量,2、光密度计扫描法,清蛋白,1,2, ,清蛋白,1,2, ,血清中各蛋白组分的含量,蛋白质类型,平均值,标准差,正常范围,（M2SD）,白蛋白,64.59,3.75,57.45%-71.73%,1-球蛋白,3.12,0.68,1.76%-4.48%,2-球蛋白,6.16,1.06,4.04%-8.28%,-球蛋白,9.09,1.15,6.79%-11.39%,-球蛋白,17.41,2.78,11.85%-22.9%,A/G,1.80,0.28,1.24-2.36,临床意义,急慢性肾炎、肾病综合征、肾功能衰竭：白蛋白降低，,1,、,2,和球蛋白升高；,慢性活动性肝炎、肝硬化：白蛋白降低，、球蛋白升高；,急性炎症：,1、,2,球蛋白升高；,慢性炎症：白蛋白降低、,2,、球蛋白升高；,红斑狼疮、类风湿关节炎：白蛋白降低，球蛋白显著升高；,多发性骨髓瘤：白蛋白降低，球蛋白升高， 和球蛋白区带之间出现“M”带。,小 结,1、本次课重要概念、原理。,2、结合基本原理和实验结果，综合分析实验操作中存在的问题。,3、醋酸纤维素薄膜电泳实验操作的细节及影响实验结果的关键因素。,4、电泳结果与临床意义。,思考题,利用本次实验课所学知识，分析以下表格中个各蛋白质的混合物在醋酸纤维薄膜电泳实验中的电泳结果？绘图表示并说明原因,。,蛋白质,等电点,分子量（KDa）,A,4.5,34.000,B,6.2,60.000,C,8.0,28.000,（注：使用pH7的电泳缓冲液，点样端置于负极）,
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