临床PCR检测技术实习生讲课

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,临床PCR检测技术实习生讲课,Kary B. MullisUSA, for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method,1930,年提出了两种核酸,DNA,和,RNA,的概念,1953,年,Watson,和,Crick,提出了,DNA,双螺旋结构及其半保留复制模型。,一、,PCR,概述,一、,PCR,概述,（一）,PCR,概念,PCR,（,polymerase chain reaction),是,一种在,体外,通过重复,DNA,合成，以扩增,特定,核苷酸序列的方法。,特点,高灵敏度,高特异性,体外进行,快捷,PCR,的概念,核心技术是从水栖高温菌中分离到能耐高温的,Taq,酶，,使扩增反应不需要每一个循环加一次,DNA,聚合,酶，从而实现了自动化。,应用领域迅速扩大，,PCR,技术,成为了分子生物学中的一项突破性技术。,PCR,概述,2000,至,2013,年发表论文,1280748,篇,一、,PCR,概述,（二）原理,双链,DNA,变性,退火,链,延伸,（膜板）,（双链分成单链）,（膜板与引物杂交）,（,DNA,合成）,不断重复,二、实验步骤,（一）核酸提取,提取,100ul,浓缩液,100ul,血清,吹打混匀,12000g,离心,5min,弃上清,20ul,提取液,100,煮,10min,模板,二、实验步骤,提取,10ulA,液,200ulB,液,震荡混匀,8000g,离心,1min,200ulDEPC,乙醇,65,干燥,10min,RNA,模板,8000g,离心,1min,逆转录,为,cDNA,弃上清,重复洗,2,次,50ul,血清,3、细胞或组织,剧烈震荡,400ul,试剂,1,加入,400ul,试剂,2,震荡混匀,12000g,离心,5min,完全弃上清,加入试剂,3,模板,加样扩增,杂交显色,（二）扩增,HBV,引物,(168bp),：,上游：,5-GAAGTGTGACGTTGACATCC,下游：,5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG,扩增体系,：（,50l,体系）,10*Buffer -5l,dNTP -1l,MgCl,2,-3l,Primer F -2l,Primer R -2l,DNA,-2l,Taq,酶,-1l,H,2,O -34l,反应程序,预变性,94,C 3min,循环,延伸,72,C 5min,。,注：每组实验阴性对照用无菌生理盐水代替模板,58,C,45 s,72,C,45 s,94,C,45 s,30,循环,（三）结果判读,（四）,PCR,的常见问题及处理措施,常见问题,污染：,表现为阴性对照同样出现目的条带或,阴性对照出现,S,形曲线。,污染的来源：,来自其他测试样品的,DNA,来自试验材料如重组克隆的,DNA,外源,DNA,污染,来自同一靶序列前一次,PCR,的扩增产物。,（三）,PCR,的常见问题及处理措施,如何减少污染,实验室分区,酶法控制,尿嘧啶,DNA,糖基化酶（,UNG),短于,100bp,的,PCR,产物不能用,UNG,完全消除污染。,紫外线表面照射,消除试剂、加样头中的,DNA,污染。,对短,PCR,产物效果不好,以预防污染为主,良好的实验室操作,三、荧光定量,PCR,（一）荧光,PCR,定量的概念,以外参已知数量拷贝数的标准品为标准，通过扩增及对荧光值的监测，对,PCR,起始模板量的定量。,（二）荧光定量,PCR,原理,染料染色,SYBR,Green I,溴乙锭,(Ethidium Bromide),探针标记,TaqMan,TM,分子信标,(Molecular beacons),TaqMan,探针,reverse primer,R,Q,forward primer,3,3,5,5,3,5,5,1. Polymerisation,probe,R,Q,3,3,5,5,3,5,5,2. Strand displacement,Q,3,3,5,5,3,5,5,3. Cleavage,R,3,5,5,3,5,5,4. Polymerisation completed,Q,R,R = Reporter,Q = Quencher,3,（三）定量,PCR,的数学原理,PCR,理 论 方 程,N = N,0,x (1+E),n,N:,扩增数量,N,0,:,起始模板数量,E：,扩增效率,n:,循环数,指数期,PCR,定量方程才有效,Log DNA,循环数,线性增长期,Linear,平台期,Plateau,y = x(1+e),n,指数增长期,Geometric,PCR,曲线,线性图谱,半对数图谱,起点定量与终点定量,起点定量,终点定量,“,加进不同拷贝的膜板,”,半对数图谱,线性图谱,同一个样品重复,96,次,起点定量的优势,终点产物数量：,误差太大,拐点产物数量：重现性好,起始,DNA,量，更具意义,重现性好，误差小,起点定量的关键：,C,T,值,C,T,值：荧光信号有统计学意义显著增长,(,穿过 阈值线,),时的循环次数,C,T,值,半对数图谱,C,T,值,线性图谱,C,T,起始,DNA,浓度,当循环次数,n=C,T,值时：,R,T,= R,B,+ X,0,(1+ E),C,T,R,s,lg (R,T,- R,B,) = lg X,0,+ C,T,lg (1+ E) + lg R,s,C,T,lg (1+ E) = - lg X,0,+ lg (R,T,- R,B,) lg R,s,即,C,T,= - k lg X,0,+ b,（,线性方程）,R,n,= R,B,+ X,0,(1+ E),n,R,s,C,T,值,-,X,0,作图,C,T,X,0,C,T,= - k logX,0,+ b,四、,PCR,检测的临床应用,（一）标本采集要求,项目,标本采集,HBV,无菌注射器抽取,2,毫升静脉血或其它体液注入无菌试管或抗凝管。,HCV,EB,1.,鼻咽拭子或体液标本。,2.,也可取抗凝血标本,但一般不推荐。,CMV,1.,尿液：中段晨尿,20ml,于加盖试管。,其他体液标本或咽拭子。,也可取抗凝血标本,但一般不推荐。,TB,1.,痰液：患者深部咳痰,1,3ml,于无菌加盖试管。,2.,其他组织标本：留于无菌试管。,3.,也可取抗凝血标本,但需分离单个核细胞检测，阳性率才会高。（于发热时抽取）,MP,咽拭子,项目,标本采集,所需容器,CT,男性：,尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道约,2,4,厘米，旋转数圈取出分泌物（应略带粘膜）。,前列腺液、精液。,女性：,阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停,5,秒后旋动棉拭子采取分泌物。,尿道分泌物：同上,一次性无菌带盖的试管。,NG,UU,TP,HPV,HSV,（二）结果分析、报告及解释,1.,定性,PCR,与定量,PCR,的比较,2.,定量,PCR,测定的临床意义,3.,定性,PCR,测定的临床意义,4.,定性和定量测定的结果报告及解释,1.,定性,PCR,与定量,PCR,的比较,琼脂糖凝胶电泳,定量,PCR,扩增曲线图,2.,定量,PCR,的临床意义,对致病微生物核酸含量进行定量检测,弥补免疫检测的缺陷,缩短诊断的窗口期（如,HBV,HIV,）,对治疗过程进行药物疗效监测,用于基因表达方面的研究,某患者,HBV-DNA,的,PCR,结果动态图,日期,HBV-DNA,2004-6-3,9.3E+7,2004-12-7,2.0E+6,2005-4-19,1.8E+3,2005-7-25,0.0E+0,3,、定性测定的临床应用,诊断,用于筛检,耐药突变检测,病毒基因型检测,GG AG GG AG AA AA,4.,定性和定量测定的结果报告及解释,（,1,）定性,阴性,阳性,（,2,）定量,(,以我科参考值为例,),HBV-DNA100 IU/ml(,不同项目数值不同,),大于参考值，在检测范围之内，是多少报多少。,大于,10,7,拷贝,/ml,，日常生活接触强传染性。,小于,10,5,拷贝,/ml,，日常生活接触传染性较小,但不管,HBV-DNA,的浓度为多少，哪怕是低于检测下限，也均会引起输血后的感染。,（,3,）血浆,HBV-DNA,浓度与传染性强弱的问题,谢 谢,