岛津液相色谱常见问题及其对策

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SHIMADZU,欢迎参加岛津液相维修培训班,1,采用 “HPLC” 级溶剂,避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂,对试样有适宜的溶解度,溶剂粘度要小,与检测器相匹配,流动相的选择,其他问题,2,其他问题,水的等级,纯化水,蒸馏水,去离子水,波长 (nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,吸光率,3,其他问题,水 / MeOH梯度,ODS 柱,鬼峰,Gradient Curve,1 ml/min, 0-100% MeOH,over 10 mins and hold for,15 mins.,鬼峰的出现,4,其他问题,溶剂的等级,HPLC级,优级纯,分析纯,都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,5,其他问题,甲醇 乙睛 正己烷,分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图,6,其他问题,溶剂的过滤,滤膜类型：,聚四氟乙烯滤膜：,适用于所有溶剂，酸和盐。,醋酸纤维滤膜：,不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。,尼龙66滤膜：,适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。,再生纤维素滤膜：,蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂,7,脱气：,除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡,气泡对测定的影响：,1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积,2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形,3）检测器中的气泡产生基线波动,其他问题,8,脱气的目的,1. 防止由气泡的产生引起的故障,2. 防止由溶解（在液体中的）气体量,的变动引起的检测不稳定程度,1）示差折射率检测器,*使折射率变化,2）UV检测器（200,nm以下）,*溶解氧气有吸收,3）荧光检测器,*溶解氧气有消光作用,其他问题,9,其他问题,脱气的方法,1.,超身波脱气法,2. He清除法,3.,使用氟树脂膜的减压脱气法,10,其他问题,He清除法,调压阀,排气阀,往送液泵,流动相,过滤器,11,其他问题,氟树脂膜,真空室,往送液泵,真空泵,控制器,流动相,使用氟树脂膜的减压脱气法,12,梯度洗脱法,梯度洗脱装置：,高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入,低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。,梯度洗脱：,优点：,可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度,13,梯度洗脱法的注意点,溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差,梯度混合的溶剂互溶性要好,梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）,查看空白实验的数据。,遵守分析周期。（最初的分析数据不采用）,14,样 品 处 理,1. 使用流动相溶解样品,- 减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要,- 保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀,15,其他问题,缓冲液,选择缓冲液的步骤,1 .确定最佳分离状态时的流动相pH,2 .选择具有与流动相的pH相近的pKa 的缓冲液,（,即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）,3 .确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收,（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和,柠檬酸的缓冲液）,16,一些代表性弱酸的pKa,pK1 pK2 pK3,醋酸 4.87,柠檬酸 3.13 4.76 6.40,磷酸 2.16 7.2 1 12.32,其他问题,17,缓冲液的使用,使用前必须过滤,使用后一定要进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损、阻塞,:,用纯水冲洗,30-60min,（,1ml/min,），,再用甲醇冲洗,30min,易受到细菌和霉菌的影响,不能直接用有机溶剂冲洗,18,液相色谱容易出问题的部件,维护流程图,吸滤头,单向阀,柱塞密封圈,线路过滤器,手动进样器,检测器,19,管线选择,材料,不锈钢,Teflon,PEEK,(,聚醚酮,),尺寸,0.1,mmI.D,.,x 1.6,mmO.D,.,0.3,mmI.D,.,x 1.6,mmO.D,.,0.5,mmI.D,.,x 1.6,mmO.D,.,0.8,mmI.D,.,x 1.6,mmO.D,.,20,管线材料,不锈钢,(可用于所有连接),能承受几千,kg/cm2,压力,酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 (尤其在,pH,小于,2时),PEEK,(,可用于所有连接),能承受高达 250,kg/cm2,压力,可在整个PH范围,(pH 1-14),内使用,不适用于高溶解性溶剂如氯仿等,Teflon,(,用于柱后阻尼管、反应管和排液管),化学惰性大,能承受 5,kgf/cm2,压力,21,材料：不锈钢烧结，孔径10um,故障：堵塞,表现：管路中不断有气泡生成,措施：用520的稀硝酸，超声波清洗，,再用蒸馏水清洗,注意点：吸滤头拆下时不必将塑料管剪断,吸滤头,液相色谱容易出问题的部件,22,LC-10ATvp,泵：串联 式往复泵,LC-10ADvp,泵：并联式 往复泵,液相色谱容易出问题的部件,23,液相色谱容易出问题的部件,单向阀结构,抛光面,透明塑料垫片,宝石球,吸液冲程,排液冲程,出口单向阀,进口单向阀,泵头,流动相,单向阀原理,吸液冲程,排液冲程,出口单向阀,进口单向阀,泵头,24,液相色谱容易出问题的部件,故障1：宝石球粘附于垫片,表现：泵无法吸液或排液，流路不通,措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压，,使宝石球与垫片分开,2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，,用超声波清洗,单向阀,25,液相色谱容易出问题的部件,故障2：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好,表现：系统压力波动大,措施：拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超,声波清洗,单向阀,26,故障：密封圈磨损而导致,密封不良,现象：系统压力波动大或,漏夜措施：更换密封圈,注意点：,更换密封圈,拆卸泵头前，柱塞杆,复位 （PSET）,柱塞密封圈,流动相,泵头清洗管路,柱塞杆,密封圈,液相色谱容易出问题的部件,27,故障：堵塞,现象：系统压力波动大或压,力偏高,措施：5稀硝酸，超声波清,洗,判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，,如压力3kgf/cm,2,，,则可能堵塞。,线路过滤器,排液阀,压力传感器,线路过滤器,流动相,液相色谱容易出问题的部件,28,液相色谱容易出问题的部件,进样器,自动进样器,手动进样器,原理：（,六通阀,）,注入方式：,1）全量注入,2）部分注入,29,液相色谱容易出问题的部件,进样量和检测器响应的关系示意图,进样体积,检测器响应值,定量,环,体积的一半,3倍定量,环,体积,全量注入,部分注入,30,手动进样器的原理图,装填状态,进样状态,31,交叉污染的原因,32,便捷的方法（不需清洗）,1.进样状态下插入微量注射器,2.切到装填状态,3.注入样品,4.切回到进样状态,手动进样法,33,操作注意点：,1）插针应插到底,2）进样应使用液相色谱专用平头进样针,3）清洗应使用专用针口清洗器,手动进样器,定子,转子,塑料箍,弹簧,不锈钢套,液相色谱容易出问题的部件,34,手动进样阀,故障：转子密封损坏,现象：漏液,原因：a 拧的太紧,b 样品太脏,c 针头损坏或不使用液相专用针,解决措施：更换转子密封，并在使用,液相色谱容易出问题的部件,35,液相色谱容易出问题的部件,手动进样阀,故障：载样困难,原因：a 定量环堵塞,b 进样器污染,解决措施：清洗或更换定量环、进样器,36,液相色谱容易出问题的部件,分析结果重现性好,提高柱效,降低柱压,保证检测稳定性,37,柱子,故障,：,系统高压、峰型变差（拖尾峰、前沿峰、分叉峰），保留时间的改变,解决措施：清洗,正相柱，正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇,反相柱，甲醇、乙腈、氯仿、异丙醇、0.05M稀硫酸,液相色谱容易出问题的部件,38,液相色谱容易出问题的部件,峰产生有肩或分叉的原因,1.,柱子劣化,（进口处产生不均匀的空隙）,2.,样品劣化,（生成氧化物、分解物等）,判断标准,所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化,39,延长柱寿命方法：,倒冲柱,换过滤片,修补柱头,液相色谱容易出问题的部件,40,液相色谱容易出问题的部件,柱的补修,41,填料的取出,液相色谱容易出问题的部件,42,恢复例,液相色谱容易出问题的部件,43,硅胶基底,聚合物基底,pH 范围,2 - 7.5,宽范围,有机溶剂,所有,有限制,压力, 250 kgf/cm2,低压,温度,宽范围,60C,色谱柱的类型及适用范围,液相色谱容易出问题的部件,44,分 析 柱 的 维 护,在,使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下,(0.2-0.3 ml/min),冲洗,30,mins,，,长时间未用的分析柱也要同样 处理,定期使用强溶剂冲洗柱子,3,、使用缓冲盐时，要先用水冲洗，再用有机溶剂冲洗,4,、,净化样品,5,、分离条件,6,、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯,7,、使用预柱,8,、避免流动相组成及极性的剧烈变化,9,、避免压力脉冲的剧烈变化,液相色谱容易出问题的部件,45,柱压低于150kgf/cm2,柱温在40左右，最高使用温度为50,缓冲液PH使用范围为27,流动相有机溶剂比例过低, 柱效下降快,硅胶在PH为34时稳定性最好,碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。,ODS,柱的使用注意点：,液相色谱容易出问题的部件,46,紫外检测器,参比池,样品池,光线,光电倍增管,液相色谱容易出问题的部件,47,更换氘灯,（紫外检测器）,判断氘灯能量：,设定,220nm,波长，检查参比池能量，如 能量低于800，需更换氘灯。,操作注意点：,不要用手直接接触氘灯表面,液相色谱容易出问题的部件,48,液相色谱容易出问题的部件,故障：样品池受污,表现：样品池和参比池能量相差较大,检查方法：设定250nm,波长，通甲醇或水，查看SMPL EN和 REF EN，如两者相差较大，则样品池受污。,措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重， 拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。,紫外检测器,49,示差折光检测器,原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。,优点：通用型检测器，,缺点：,1）对温度变化敏感,2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测,3）属于中等灵敏度的检测器,50,液相色谱常见问题及其对策,液相色谱常见问题类型,A.,压力异常（偏高、波动）,B.,漏液,C.,保留时间漂移,D.,基线问题（漂移、噪声）,E.,峰形异常,51,现象：无压力，流动相不流动,可能原因,1、保险丝断或电源问题,2、柱塞杆折断,3、泵头内有空气或流动相不足,4、单向阀损坏,5、漏液,6、压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力),压力异常,52,现象：压力持续偏高或不断上升,1、流速设定过高,2、保护柱或柱子筛板堵塞,3、流动相使用不当或有缓冲盐析出,4、色谱柱选择不当,5、进样阀损坏,6、线路过滤器堵塞,压力异常,53,压力异常,现象：压力持续偏低,1、流速设定过低,2、色谱柱选择不当,3、柱温过高,4、系统漏液,54,现象：压力持续偏低,1、流速设定过低,2、色谱柱选择不当,3、柱温过高,4、系统漏液,压力异常,55,压力异常,现象：压力波动,可能原因,1、泵头中有气泡,2、单向阀损坏,3、柱塞密封圈损坏,4、脱气不充分,5、系统漏液,6、使用了梯度洗脱,56,漏液,接头处漏液,1、接头处松动,2、接头磨损,3、接头被污染,4、部件不匹配,57,漏液,泵漏液,1、单向阀松动,2、泵密封损坏,3、放空阀损坏,4、接头松动（不要拧的太紧）,58,漏液,泵漏液,1、单向阀松动,2、泵密封损坏,3、放空阀损坏,4、接头松动（不要拧的太紧）,59,进样阀漏液,可能原因,1、转子密封损坏,2、定量环堵塞,3、进样口密封松动,4、进样针尺寸不合适,5、废液管产生虹吸,6、废液管堵塞,漏液,60,检测器漏液,可能原因,1、流通池垫片损坏,2、流通池透镜破碎,3、手紧接头处漏液,4、进样针尺寸不合适,5、废液管堵塞,6、流通池堵塞,漏液,61,保留时间漂移,可能原因,1、柱温变化,2、流动相组分变化,3、色谱柱没有平衡,4、流速变化,5、泵中有气泡,6、流动相选择不当,7、键合相流失,8、缓冲容量不够,保留时间漂移,62,基线漂移,可能原因,1、温度波动,2、流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂),3、流通池被污染或有气泡,4、流通池窗口破裂,5、流动相配比不当或流速变化,6、柱子平衡（约3060min）,基线问题,63,基线漂移,可能原因,7、流动相污染，变质或由低品质溶剂配成,8、样品中有强保留的物质以馒头样峰被洗出,9、检测器没有设定在最大吸收波长处,基线问题,64,基线噪声（规则的）,可能原因,1、流动相、泵、检测器中有气泡,2、有地方漏液,3、流动相混和不均匀,4、温度影响（检测器和柱温差别太大）,5、其他电子设备的影响,基线问题,65,基线噪声（不规则的）,可能原因,1、流动相污染、变质或由低质溶剂配成,2、有地方漏液,3、流动相各溶剂不相溶或混和不均匀,4、流通池污染,5、检测池能量不足,6、系统内有气泡,基线问题,66,前沿峰、拖尾峰,可能原因,1、柱塞板堵塞,2、色谱柱塌陷,3、柱外效应,4、干扰峰,5、缓冲不足或不合适,6、化学或次级保留（硅羟基效应）,峰形异常,67,前沿峰、拖尾峰,可能原因,7、重金属污染,8、样品溶剂选择不当,9、样品过载,10、柱温过低,峰形异常,68,分叉峰,可能原因,1、保护柱或分析柱污染,2、样品溶剂不溶于流动相,峰形异常,69,峰展宽,进样体积过大,流动相粘度过高,检测池体积过大,保留时间过长,柱外体积过大,样品过载,峰形异常,70,峰变形,可能原因,1、样品过载,2、样品溶剂选择不当,峰形异常,71,鬼峰,1、进样阀残余峰,2、样品中未知物,3、柱未平衡,4、水污染,5、三氟乙酸氧化,72,