PCR技术及其应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR技术及其应用,申 红,基础医学教研室,聚合酶链反应( Polymerase Chain Reaction, PCR无细胞的分子克隆法)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点。,能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍.,PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,生物样品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,PCR技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,解旋酶,解链酶,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,PCR技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,引物酶,引物酶,RNA引物,RNA引物,PCR技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,GGAUCG,5,AUCGCG,5,TAGCGCTATCGCATCGACGCT,3,ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG,3,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,PCR技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。,但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发展都使克隆基因没有成为现实，所以，Khorana的设想被人们遗忘了,PCR技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）。,基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制。,最初采用E-coli DNA聚合酶,I 的Klenow,片段进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错。,PCR技术简史,DNA,的复制,核酸体外扩增的设想,聚合酶链反应的发明,1988年Saiki 等从水生嗜热杆菌(Thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶，命名为Taq DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪，使PCR技术得到了广泛应用,1993年，Mullis因此项技术获诺贝尔化学奖,PCR的基本原理,PCR,过程,PCR,反应条件,PCR,的特点,模拟DNA的体内复制过程,即利用DNA聚合酶在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成。,PCR技术基本原理 : 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：加热至93左右后，成为单链，与引物结合，作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物,在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环,变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,PCR的基本原理,PCR,过程,PCR,反应条件,PCR,的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复1-3步,25-30轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,DNA变性,形成2条单链,子链延伸,DNA加倍,变性,（denaturation）,在高温条件下（90,95），双链模板DNA的氢键断裂，解链成两条单链DNA，提供复制的模板。,变性温度与时间：,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因,一般9394lmin足以使模板DNA变性,若低于93则需延长时间,但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。,模板DNA,94,退火,（annealing）,在低温条件下（40,65），使加入的引物与,单链DNA模板上,待扩增DNA区域的两个侧翼准确地配对结合，并提供DNA复制起始的3-OH。,退火(复性)温度与时间：,退火温度,是影响PCR特异性的重要因素,退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度,对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,50,引物1,引物2,DNA引物,变性后温度快速冷却至4060，,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA,比引物复杂得多，而且引物的分子数远,远多于模板DNA，故引物与模板DNA结合,的机率远远高于DNA分子自身的复性。,延伸（,extension,）,DNA,聚合酶在适当温度（,70,75,）下，以dNTP为原料，从特异结合到,DNA,模板上的引物,3,-OH,端开始，根据碱基互补配对和半保留复制原则，进行DNA链的延伸，合成与模板互补的新的,DNA,分子。,大肠杆菌体内各聚合酶作用,DNA 聚合酶 ,无,53外切酶活性切除引物,是复制时的主要聚合酶；,DNA 聚合酶 I:,主要负责除去引物并利用脱氧核苷酸填满空隙； 1.,53聚合酶活性。2. 53外切酶活性切除引物。3. 3,5外切酶活性起校对作用,DNA 聚合酶,有1和3的作用，其他作用尚不清楚。,DNA 聚合酶和,涉及DNA错误修复。,延伸温度与时间：,Taq DNA聚合酶的生物学活性： 7080,150,核苷酸/S/酶分子 70,60,核苷酸/S/酶分子 55,24,核苷酸/S/酶分子,延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在7075之间,常用温度为72,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。,延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）,34kb的靶序列需34min,扩增10Kb需延伸至15min,延伸时间过长会导致非特异性扩增,对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,70,引物1,引物2,DNA引物,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第1轮结束,94,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,94,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR产物的积累规律,DNA,扩增过程遵循酶促动力学原理。,反应初期，目的,DNA,片段呈指数形式（,2,n,）,增加，随着目的,DNA,片段的积累，在引物,模板与,DNA,聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，被扩增的,DNA,片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期,平台期，这种效应称平台效应。,（,25-30,个循环）,PCR的基本原理,PCR,过程,PCR,反应条件,PCR,的特点,标准的PCR反应体系,10扩增缓冲液 10ul,Mg,2+,1,.,5mmol/L,4种dNTP混合物 各200umol/L,引物 各10100pmol,模板DNA 0,.,12ug,Taq DNA聚合酶 2,.,5u,加双或三蒸水至 100ul,PCR操作程序, 向一微量离心管中依次加入缓冲液、 Mg,2+,、dNTP、引物、 DNA模板、,Taq,DNA聚合酶然后用双蒸水加到最佳体系 。混匀后，离心数秒，使反应成分集于管底。, 加矿物油50100l于反应液表面（防蒸发）,置反应管于PCR仪上，设置程序，进行热循环。,部分基因组,DNA,Fig1.1 Genomic DNA extracted from blood of part sheep,296bp,M,DRB,1基因外显子PCR结果检测的电泳图, 琼脂糖凝胶电泳（1-2%）检测扩增酶切产物。,片段长度(核苷酸数)琼脂糖凝胶电泳的核苷酸数与凝胶的范围。 DNA片段长度的检测（0.8%）PCR扩增产物检测（1.5%）。酶切片段检测（2-3.5%）。,片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺,1Kb700bp 3.5 (%),700b500b 5 (%),500b200b 8 (%),200b 12(%),PCR反应五要素,引物（primer）,酶 （Taq DNA polymerase）,dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP）,模板 （template）,Mg,2+,（magnesium）,1、引物,引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度,理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增,基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。,引物设计的原则,引物长度：,15-30bp，常用20bp左右, 引物的有效长度不能大于 38 bp，否则最适,延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度 （74），不能保证PCR扩增产物的特异性。,引物扩增跨度：,以500bp为宜, 特定条件下可扩增长至10kb的片段,引物碱基：,G+C含量以40-60%为宜, G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非,特异条带, ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或,嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3端不应超过3,个连续的G或C，因为这样会使引物在G+C富,集区 引发错误延伸,避免引物内部出现二级结构和,引物间互补,特别避免 3端的互补，否则会形成引物二聚,体，产生非特异性的扩增条带,引物 3端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）, 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端,碱基不配对而导致PCR失败,引物5端可修饰,引物5端限定着PCR产物的长度，但对扩增特,异性影响不大；引物5端碱基可不与模板DNA,互补而呈游离状态；引物5端最多可加10个碱,基而对PCR反应无影响,引物的特异性：,引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性,引物量：,每条引物的浓度或10 100 pmol以最低引物量产生所需要的结果为好, 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,2、酶及其浓度,目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应,天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯,基因工程酶：大肠菌合成,一个典型的 PCR反应约需酶量ul体系,浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,DNA,聚合酶,Klenow,片段,T4 DNA,聚合酶,Taq,DNA,聚合酶（应用最广）,其他,DNA,聚合酶：,Tth,DNA,聚合酶,Vent,DNA,聚合酶,Pfu,DNA,聚合酶等,Taq,DNA聚合酶的特性,酶活性,该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa。,其比活性为200000单位/mg。7580时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70延伸率大于60个核苷酸/秒，55时为24个核苷酸/秒。温度过高(90以上) 或过低(22)都可影响Taq DNA聚合酶的活性。,热稳定性,有良好的热稳定性，在92.5、95 、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min和56min后，仍可保持50%的活性。,Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。,离子依赖性,Taq,DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，对Mg2+浓度非常敏感。,以活性程度很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为时，用不同浓度Mg,2+,进行 PCR反应10min，测定结果为MgCl,2,浓度在时该酶催化活性最高，此浓度能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。,Mg,2+,过高就抑制酶活性，当MgCl,2,浓度在 10mmol/L时可抑制4050%的酶活性。,忠实性,聚合酶的功能？2.合成方向？3.为什么不是35？(再次磷酸化需能量),三种聚合酶只有2没有校正活性，,TaqDNA聚合酶具有53聚合酶活性和53外切酶活性（切除引物），而无35外切活性(校正），因而，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能的。保真性不如,Pfu,DNA聚合酶等。,Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110,-4,。而DNA复制时10,9,-10,10,才错配。,3、dNTP,的质量与浓度,dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系,dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活,dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解,1.在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量,2.注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低）,就会引起错配,可与Mg,2+,结合，使游离的Mg,2+,浓度下降,，,影响DNA聚合酶的活性,4、模板DNA,模板DNA的来源：,微生物中提取DNA,从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛,发、精斑、口腔上皮细胞,固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化,模板DNA的浓度：,2ug/100ul体系,PCR产量随模板DNA浓度的增加而显著升高,模板DNA浓度过高会导致非特异性产物增加。,5、Mg,2+,浓度,Mg,2+,对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg,2+,浓度为2.0 mmol/L为宜。,Mg,2+,浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,6、,循环次数,循环次数,决定PCR扩增程度,主要取决于模板DNA的浓度,选在3040次之间,循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,如何避免引物二聚体,形成,？,（1）两种引物如果3,端互补的话，便容易出现引物二聚体。通过引物设计可避免。,（2）几种聚合酶（包括,Taq,DNA聚合酶）已被证明具有较弱的非模板指导的聚合作用，该作用可以将核苷酸添加到一条引物的3,端，与另一条引物形成短的重叠。应用最低量的引物和酶来减少引物二聚体发生。,如何提高,PCR,过程中的,DNA,聚合酶的保真性？, 在PCR反应体系中，除使用,Taq,DNA聚合酶，掺入,少量的具有35外切酶活性的耐热DNA聚合,酶，如,Pfu,，,Vent,，,Pwo,等，错配率可降为原来的,1/10；, 使四种dNTP浓度相等；,Mg2+,浓度尽可能低，但不影响DNA合成；, 减少高温反应时间，这样DNA热损伤将减少；, 减少循环数;, 反应体系pH值在70时尽量低于。,如何提高PCR扩增的特异性,？, 升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；, 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及多余的DNA聚合酶分子参与酶促延伸的机会；,降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发；, 改变Mg,2+,的浓度可进一步提高扩增的特异性；, 引物设计的特异性；, 减少循环次数；, 热启动（Hot Start）。即首先将模板变性，,然后在较高温度时加入,Taq,DNA聚合酶、引物及,MgCl,2,等一些重要成分，这样使得引物在较高温,度下与模板退火，提高了反应的严谨性，使扩,增更特异；, 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来提高,扩增的特异性。,PCR的类型和应用,研究,基因克隆，,DNA,测序，分析突变,诊断,细菌、病毒、寄生虫检测,人类基因组工程,遗传图谱的构建，,DNA,测序，表达图谱,法医,犯罪现场标本分析,肿瘤,各种肿瘤检测,其他,PCR的类型和应用,类型：,逆转录PCR 反向PCR,巢式PCR,标记PCR,多重PCR 原位PCR,不对称PCR,定量PCR,锚定PCR 差异显示PCR,长PCR 免疫PCR,RACE RAPD,PCR-FRLP PCR-SSCP,1、RT-PCR及定量RT-PCR,（1）RT-PCR,（reverse transcription-PCR）,原理：先在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合成互补的cDNA（complementary DNA），再以cDNA为模板进行PCR反应，这样，低丰度的mRNA得以扩增放大。是一种快速、简便、敏感性极高的检测mRNA表达的方法。,oligo （dT）一般指的是多个T碱基连接而成的寡聚引物，其长度有多种，至少包括oligo d(T)10、oligo d(T)12、oligo d(T)14和oligo d(T)16这么几种。最好15以上，否则效率有所降低，而且也更容易与RNA中的寡聚A的位置结合而起始反转，使cDNA效率下降。,常用的两种逆转录酶,AMV（,avian myeloblastosis virus,）：,酶活性最适温度,42,MMLV（,Moloney murine leukemia virus,）：,酶活性最适温度,37,（2）定量RT-PCR（QRT-PCR）,：,通,过,设立一定的RNA竞争性参考标准（RNA competitive reference standard,RNA-CRS)，利用RT-PCR对mRNA 水平进行半定量或绝对定量分析。, 半定量RT-PCR,选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的“管家”基因mRNA,作为,内源性基因模板标准。“管家”基因mRNA和目的mRNA混合物共同,进行,逆转录，在各自的引物引导下共同扩增。计算出扩增后目的cDNA/“管家”基因cDNA的比值，从而达到半定量的目的,。,半定量RT-PCR的不足,由于管家基因的mRNA与靶基因使用不同的引物，两种mRNA在序列、大小及二级结构上可能亦存在较大的差异，使两者的扩增效率差异极大，从而影响定量的准确性；,不同来源的组织或细胞的mRNA可能有着不同的逆转录效率，这种逆转录效率的差异在随后进行的PCR中被成百万倍地放大,。,2、实时荧光,定量,PCR,荧光共振能量传递 (FRET) ：某荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。,荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,荧光定量PCR仪比普通的PCR仪多了荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，实时荧光定量PCR仪主要是用来定量分析和确定基因转录水平的，而普通的PCR仪是做定性分析和扩增基因片段，定量PCR仪可以做普通PCR仪的工作，而反之就不行了，况且这样代价太大了，一般的实验室都不允许这样做的。总之两者的功能不能互相取代。,常规定量PCR技术：,对,PCR,扩增反应的,终产物,进行定量,重复性差,半定量,实时定量PCR技术：,对,PCR,扩增反应中,每一个循环的产物,进行定量,实时荧光定量PCR原理,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。,（1）Ct 值,是荧光定量PCR技术的一个很重要的概念,C代表Cycle，t代表threshold。,含义是：每个反应管内的荧光信号到达,设定的域值时所经历的循环数。,（2）荧光域值（threshold）的设定,PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ,SDcycle,3-15,Ct值的确定,相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图Ct值则极具重现性,（3）Ct值与起始模板的关系,研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,荧光定量标准曲线,特异性强：,具有引物和探针的双重特异性,重复性好：,同一标本的Ct值相同,敏感性高：,可检测百万分之一个感染细胞或,病毒DNA分子,线性范围广：,定量的动态范围达5-6个数量,级，因而相差较大的DNA起始拷,贝数也不需稀释,工作效率高：,一次定量96个样品仅需1-2h,但仪器及配套试剂极其昂贵,实时荧光定量PCR的特点,用途,􀂉,定量起始模板浓度,􀂉基因型分析,􀂉产物鉴定,􀂉,单核苷酸多态性（,SNP,）检测,3、反向PCR（inverse PCR，IPCR）,IPCR是对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究的一种简捷方法。,原理：,用限制性内切酶消化DNA片段，然后用连接酶将酶切产物连接成环状，再用已知序列上两端相反方向的引物进行PCR,。,反向,PCR原理图（A和B分别为限制性内切酶位点；P1,、P2,分 别为引物； 黑色区域为已知序列；空白区域,为未知,序列）,反向PCR成功要点, 第一步选择限制性内切酶消化基因组DNA模板时，必须选择已知DNA上无该酶切位点的限制性内切酶，若产生粘性末端DNA片段则更易于环化。, 限制性内切酶消化后产生的DNA片段大小要适当，太短（200300bp）则不能环化，太长的DNA片段则受PCR本身扩增片段有效长度的限制。,4、原位PCR(In-situ PCR),原位,PCR,是在组织细胞里进行,PCR,反应，它结,合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特,异敏感的,PCR,技术的优点。,原位,PCR,是,Hasse,等于,1990,年建立的，实验用,的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细,胞、血细胞等。,基本方法：,固定组织或细胞：多聚甲醛处理,蛋白酶,K,消化处理,PCR,扩增：加,PCR,反应液在组织细胞片上，覆,盖液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上,进行,PCR,循环扩增。有的基因扩增仪带有专,门用于原位,PCR,的装置。,杂交：,PCR,扩增结束后，用标记的寡核苷酸探,针进行原位杂交。,显微镜观察结果。,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,原位,PCR,既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值,;,其特异性和敏感性高于一般的,PCR,。,。,5、巢式PCR（nested PCR，N-PCR）,由于扩增模板含量太低，为了提高检测灵敏度和特异性，采用改进过的PCR-RFLP方法即 N-PCR。,N-PCR,是设计两对引物，一对外引物（,outer primer,）,对应的序列在模板的外侧，另一对内引物（,inner primer,）,在同一模板的外引物的内侧，即外引物扩增产物较长，含有内引物扩增的靶序列，这样经过二次,PCR,放大将单拷贝的目的,DNA,片段检出。,296bp,M,第二轮PCR检测结果,第一轮PCR检测结果：没有目的条带出现。,N-PCR的优点是：第一，克服了单次扩增“平台效应”的限制，使扩增倍数提高，从而极大地提高了PCR扩增的敏感性。第二，由于模板和引物的改变，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性。第三，内侧引物扩增的模板是外侧引物扩增的产物，第二阶段的反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，因此可以保证整个反应的准确性及可行性。,N-PCR的缺点是：进行二次PCR扩增引起交叉污染的几率大。,我们为了克服此缺点，可采用同一反应管中巢式PCR（one-tube nested PCR）,主要利用内外引物Tm值不同。外引物Tm高，内引物Tm低，PCR反应开始的若干轮循环采用较高的退火温度，内引物由于Tm值低，高温下无法与模板结合不能延伸，而外引物可与模板退火延伸，再采用较低的退火温度进行后面的循环，内引物则可与模板退火延伸，这样实际上进行了二次扩增，但只进行一次操作，可减少交叉污染的机会。可采用同一反应管巢式PCR，主要利用内外引物的Tm值不同。外引物的退火温度高于内引物退火温度。进行两次PCR扩增，一次操作，可减少交叉污染机会。,PCR反应是一个复杂的生物化学反应体系，各成分之间存在着动态的相互作用，每一个条件的改变都会影响到整个PCR的效果，因此在实验过程中对反应条件应做综合的考虑。进行一系列的巢式PCR反应体系优化，通过Mg2+浓度、引物浓度、退火温度的梯度比较选择，来确定实验的最佳反应体系。,6、不对称PCR（asymmetric PCR）,不对称PCR的目的是扩增产生特异长度的单链DNA。此法产生的单链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。,用一对不等量的引物，这对引物分别称为非限制引物,(,高浓度引物,),与限制性引物,(,低浓度引物,),，其比例一般为,50,1001.,在,PCR,反应的最初,10,15,个循环中，其扩增产物主要是双链,DNA,，,但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的,PCR,就会产生大量的单链,DNA,。,高浓度引物,低浓度引物,不对称,PCR,的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。,还有一种方法是先用等浓度的引物,PCR,扩增，制备双链,DNA,，,然后以此双链,DNA,为模板，再以其中的一条引物进行第二次,PCR,，,制备单链,DNA,。,7、多重PCR(multiple PCR),多重PCR又称多重引物PCR或复合PCR，是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增一份DNA样品中的不同序列。,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,多重PCR,电泳,引物,8、标记PCR,（Labelled primers，LP-PCR),利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。,特别适合大量临床标本的基因诊断,可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,标记引物,观察,PCR产物,9、锚定PCR,已知靶基因片段两测的序列,VH,CH1,CH1,CH2,CH2,CH3,CH3,VH,VL,VL,CL,CL,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,10、,快速扩增cDNA末端,（,rapid amplification of cDNA ends,，,RACE,）,RACE是一种由已知的部分cDNA序列来快速获得完整cDNA 5或3末端的PCR技术。,原理：,首先从已知的部分cDNA序列选择3和5,端,方向的引物，两种引物分别与3或5端寡聚dT引物组合扩增3或5,端,cDNA，最后从两个有相互重叠的3或5,端,RACE产物来获得全长cDNA序列。,11、,mRNA差异显示逆转录PCR（mRNA differential display RT-PCR,，,DDRT-PCR,）,DDRT-PCR是目前筛选差异表达未知基因,的,有效方法之一。,原理：,利用真核细胞mRNA均含poly（A）末端的特点，把3,端引物设计成T,12,MN（M=A，C或G，N=A，G，C或T），共12条，与mRNA 3,端poly A结合，进行逆转录，形成mRNA:cDNA杂交分子，5,端采用20条随机引物，与锚定引物一起进行PCR扩增，通过比较实验与对照样本mRNA表达谱，差异表达的基因会全部呈现出来。回收克隆鉴定差异条带,。,优点,此法是一种简便、灵敏、高效、快速筛选差异表达未知基因,方法。,缺点,具有较高频率的假阳性和短小的差异片段等缺点,，从而限制了此方法的广泛应用。,12、代表性差示分析（representational difference analysis, RDA,）,RDA,是一种新的依赖PCR技术的有效地筛选和克隆差异表达基因的方法。,13、,PCR-SSCP,（,PCR-single strand conformation polymorphism,）,分析,PCR产物单链构象多态性分析是一种适合大样本筛查基因突变的分析方法。,PCR-SSCP原理是：,在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，单链DNA的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于该DNA单链所形成的构象,。,相同长度的单链DNA分子可因其序列的不同，甚至单个碱基不同，而形成不同的构象，导致在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率发生改变。从而达到检测基因突变的目的。该方法对小于200bp的DNA片段中存在的突变几乎可全部检测。,检出,PCR-SSCP分析的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。,PCR产物SSCP多态性检测的具体操作过程,A. 丙烯酰胺凝胶的制作：,1）用温热含去污剂的水清洗玻璃板，充分漂洗(先用自来水，再用去离子水)，晾干。,2）配对玻璃板用夹子固定在板架上，底部用2%琼脂糖封底。,3）根据目的片段的大小配胶(分子克隆419 P)，用磁力搅拌器充分混合各组份后，进行灌胶。倒胶时要避免小气泡的产生。,4）插入梳子，室温下聚合30-60 min。,5）回收封底琼脂糖胶，不要将凝胶板间的琼脂糖胶活动，将凝胶板夹在电泳槽上。,6）拔梳子，加入1TBE缓冲液。,B. 样品的电泳及固定、染色、显影和终止,1） 取3 L 特异性好的PCR产物加7 L SSCP上样缓冲液混合，98变性10 min，立即冰浴10 min，用非变性聚丙烯酰胺凝胶(高板)进行电泳检测。电泳条件为300 V预电泳5 min，使样品快速入胶，然后室温恒压150 V电泳12-16 h。,2）固定：从玻璃板上小心取下凝胶，用蒸馏水洗3次，加入固定液固定15 min。,3）染色：回收固定液，用蒸馏水冲洗3次，每次不超过1 min，然后放入染色液中染色20 min。,4）显影：回收染色液，用蒸馏水冲洗3次，每次不超过30 s，放入显影液中显影，待凝胶上看到目的条带，停止显影。,5）终止：将显影后的凝胶放入上述固定液中终止显色反应5-10 min。对胶进行拍照，统计各基因型的个体数。,该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。 为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。例如，可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷，也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。,用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于200bp的片段，SSCP可发现其中70的变异；对于300bP左右的片段则只能发现其中50的变异；而500bp的片段，则仅能检出103O的变异，因此，300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bP的DNA片段，再进行SSCP分析。,在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:,DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺,1Kb700bp 3.5 (%),700b500b 5 (%),500b200b 8 (%),200b 12(%),在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).,DRB,1-SSCP结果：,DD,EE,GG,DD,DD,HH,FG,LL,DD,DD,MM,FF,II,多浪羊,DRB,1基因外显子2的PCR-SSCP电泳图,Electrophoretic patterns of PCR-SSCP of,DRB,1 exon 2 in Dolang sheep,DQB,1-SSCP结果：,BD KK LL II II JJ NN MM CC BB DD CC NN HN AA AA,FI BD AF EE KK II LL GG NN MM OO PP JJ LL NN OO KK JJ NN,多浪羊,DQB,1基因外显子2的PCR-SSCP电泳图,Electrophoretic patterns of PCR-SSCP of,DQB,1 exon 2 in Dolang sheep,选取部分基因型个体进行克隆测序,将测序结果与GenBank(FN393736.1)中MHC-,DRB,1第2外显子的核苷酸序列进行比对。结果见下图：,FN393736.1 CACATTTCTTGGAGTATACTAAGAAAGAGTGTCGTTTCTC 40,带型CC -a-t 40,带型KK -t-c-gc- 40,带型FF -ca-gc- 40,带型LK -ta-ggc-a-t 40,FN393736.1 CAACGGGACGGAGCGGGTGCGGTTCCTGGACAGATACTTC 80,带型CC -g-a- 80,带型KK -a- 80,带型FF -a- 80,带型LK -c-g-c-t-a- 80,FN393736.1 TATAATGGAGAAGAGTACGCGCGCTTCGACAGCGACTGGG 120,带型CC -t- 120,带型KK -t- 120,带型FF -ac-ct- 120,带型LK ac-ac-t- 120,FN393736.1 GCGAGTACCGAGCGGTGGCCGAGCTGGGGCGGCCGGACGC 160,带型CC -t-g- 160,带型KK - 160,带型FF -g-ag- 160,带型LK -t-g-a-c-a-a-ga- 160,FN393736.1 CAAGTACTGGAACAGCCAGAAGGAGCTCCTGGAGCGGAAG 200,带型CC -tt-a-c-g- 200,带型KK - 200,带型FF -g-ct-a-c- 200,带型LK -g-c-a- 200,FN393736.1 CGGGCCAATGTGGACACGTACTGCAGACACAACTACGGGG 240,带型CC a-a-gcg- 240,带型KK - 240,带型FF -g-g- 240,带型LK -g-g-gtg-t- 240,FN393736.1 TCGGTGAGAGTTTCACTGTGCAGCG 265,带型CC - 265,带型KK -tt- 265,带型FF -at- 265,带型LK -t- 265,为了检测碱基的突变是否引起了氨基酸的变异，将突变型的核苷酸序列转变成氨基酸序列，然后与MHC-,DRB,1第2外显子（）所编码的氨基酸进行比对，结果见图,：,上,图基因型CC、KK、FF、LK个体,氨基酸,与MHC-,DRB,1基因外显子2氨基酸序列比对,我们对,DRB,1基因的部分带型进行了测序分析。发现,DRB,1基因是典型的多碱基突变，而且大部分的碱基突变引起了所编码的氨基酸的改变，只有个别突变是沉默突变。由于碱基突变而引起所编码氨基酸序列的改变，这可能是不同基因型个体表现出包虫病抗性或易感性的根本原因，因为氨基酸序列一旦改变，所表达的蛋白质亦随之改变。至于突变后，究竟是哪种功能性蛋白质在抗性或易感性中起关键作用，而它又是如何调控这种机能的，还有待于深入研究。,影响PCR-SSCP两方面因素,影响PCR扩增特异性的因素均可影响PCR-SSCP分析；,影响PCR产物单链电泳的因素，它们包括聚丙烯酰胺凝胶浓度和交联度、电泳温度、凝胶中甘油（弱变性剂）的浓度、电泳缓冲液离子强度等。,SSCP的应用,（1）用于检测和肿瘤发生有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等.,(2)用于检测引起人类遗传性疾病的研究上，如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤 1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中.,(3)用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染情况、以及病原体传播途径的研究中.,(4)用于DNA定量分析上.,14、,Alu,-PCR,原理: 哺乳动物基因组的特点是包含许多短的重复DNA序列，散布于基因组DNA中的,Alu,序列是人类基因组中主要的重复序列，其拷贝数约为900,000。利用,Alu,高度保守区序列设计引物，扩增未知DNA片段的方法称,Alu,-PCR,Alu-PCR方法特点在于利用人DNA中普遍存在的Alu重复序列，这种300bp序列的拷贝约 个，分布于整个人基因组。虽然Alu重复列各拷贝间有很大差别，但已确定 出了一个相序同序列，且重复子中一些区域是极为保守的。我们认为，可设计合适的能 识别这些保守区的PCR引物，进行有效的内-Alu扩增，从复杂源中分离人DNA。为了只 扩增体细胞杂合子中人DNA而不同时扩增啮齿类Alu等位子，我们需要鉴定人特异引 物。,Alu,-PCR 注意要点,靶DNA中,Alu,序列的数目及分布在,Alu,-PCR中起决定作用。,Alu,序列在基因组DNA中的排列方向决定着,Alu,-PCR引物的选择。,15、长PCR（long PCR）,当利用PCR扩增长度超过5kb片段时，其扩增效率显著下降（即长片段产量明显减少）。,耐热DNA聚合酶是影响长PCR是否顺利扩增的一个关键因素。,长PCR成功扩增策略,多种耐热DNA聚合酶如,Taq,DNA 聚合酶和,Pfu,或,Tli,DNA聚合酶混合使用；,缩短变性时间 20s；,增加延伸时间，可达1020分钟，依模板长度而定。,Thank you,