何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,*,第五章基因的转移与重组体的筛选和鉴定,一、粘性末端的连接,DNA,连接酶把相互靠近的,5,端磷酸,与,3-OH,连到一起,单酶切、双酶切,第一节,DNA,的体外重组,DNA,的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的,DNA,称为重组,DNA,。,（一） 直接连接,T4 DNA,连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的,110%,。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,二、平末端（,blunt end,）的连接,（,1,）同聚加尾法,（二） 人工加尾形成 “粘性末端”,DNA,末端转移酶,能在没有模板的情况下给,DNA,的,3-OH,端,加上脱氧核苷酸。, 原理：,分别给载体和插入片断加上,互补的,核苷酸。, 加尾碱基互补,缺点：,优点：,能把任何片段连接起来,操作繁琐；,外源片段难以回收,；,同聚物尾巴影响外源基因表达。,非酶切位点,（,2,）衔接物（,linker,）连接,Linker,：,用化学合成法合成的一段,10-12bp,的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的,平末端双链寡核苷酸,G,GAATTC,C,C,CTTAAG,G,Eco,R I linker,：,（二） 人工加尾形成 “粘性末端”,（,1,）多核苷酸激酶处理,（,2,）,T4,连接酶连接,（,3,）限制性内切酶消化,（,4,）目的片段与载体连接,（二） 人工加尾形成 “粘性末端”,（,3,）,DNA,接头 （,adapter,）连接法,adapter,一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）,Blunt-ended DNA,5p-,GATC,CCGG-OH3,3HO-GGCC-p5,Bam,HI adapter,P-,-P,5p-,GATC,CCGG-,GGCC-,-CCGG,-GGCC,CTAG,-P5,接头与接头以粘末端连接，影响与,DNA,片段的连接, 优点：,连上后就能用。, 缺点：,先用小牛肠,碱性磷酸酶,（,CIP,）处理接头，水解掉其,5,端的磷酸，防止自我连接。, 防止自我连接,5p-,GATC,CCGG-,GGCC-,CCGG,GGCC,CTAG,-p5,Blunt-ended DNA,5,p-,GATCCCGG-3,GGCC,-p,5,Bam,HI adapter,P-,-P,5,HO-,GATCCCGG-,GGCC,CCGG,-GGCCCTAG,-OH,5,5,HO-,GATCCCGG3,GGCC,-OH,5,nick,缺口,nick,缺口,HO-,-OH,CIP,处理,T4 ligase,虽然有缺口，但仍然能与,DNA,片断连接,T4,多核苷酸激酶处理使,5,磷酸化,三、,PCR,产物的连接,1.,在引物的,5,端设计酶切位点,符合载体的多克隆位点；,（,1,）设计原则,（,2,）带酶切位点的引物的结构,3,端,15,20bp,与模板互补；,5,端内切酶识别序列,保护碱基,避免与所扩增的,DNA,片断内部酶切位点重复。,三、,PCR,产物的连接,1.,在引物的,5,端设计酶切位点,请设计一对,PCR,引物，在,N,端和,C,端分别加一个,Eco,RI,（,GAATTC,，保护碱基,GCA,）和,Bam,HI,酶切位点（,GGATCC,，保护碱基,CGC,），另外，各含有,18,个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列。写出,P1,和,P2,的引物序列。,带酶切位点的,PCR,产物,GCA,GAATTC,PCR,产物,5-,-3,CCTAGG,CGC,PCR,产物,-5,3-,CGTCTTAAG,GGATCCGCG,Eco,R I,位点,Bam,H I,位点,AATTC,PCR,产物,5-,-3,CCTAG,PCR,产物,-5,3-,G,G,Eco,R I,Bam,H I,两头各有一个粘性末端！,A,A,dNTP,T,T,dTTP,Taq DNA,聚合酶,载体,PCR,产物,TA,TA,三、,PCR,产物的连接,2.,与,T,载体直接连接,三、,Gateway,载体构建系统,噬菌体位点特异性重组系统；高效的实现,DNA,序列在多种载体系统的转移。,入门克隆,改造过的各种表达载体,三、,Gateway,载体构建系统,（,1,）创建入门克隆,BP,反应：,attB+attP,attL,+attR,，产物：入门克隆,入门克隆,改造过的各种表达载体,三、,Gateway,载体构建系统,（,2,）构建表达克隆,LR,反应：,attL+attR,attB,+attP,，产物：表达克隆,入门克隆,改造过的各种表达载体,第二节 重组体导入受体细胞,一、重组,DNA,导入大肠杆菌,（一）转化（,transformation,）,大肠杆菌捕获,质粒,DNA,的过程。,（三）转染（,transfection,）,受体菌直接捕获,噬菌体,DNA,的过程。,（二）转导（,transduction,）,借助,噬菌体,把外源,DNA,导入细菌的过程。,（一）转化（,transformation,）,（,1,）热激法（,heat shock,）,（,2,）电转化法（,electronporation,）,（,3,）,PEG,介导的原生质体转化,（,4,）接合转化,制备感受态细胞,增加受体菌细胞膜的通透性,（,1,）热激法,目的,感受态细胞：,处于能吸收外源,DNA,分子的生理状态的细胞,制备感受态细胞,1,、将处于对数生长期的细菌置于,0,的,CaCl,2,低渗溶液中，细胞膨胀成球形，处于感受态；,2,、将感受态细胞与,DNA,混合，,Ca,2+,与,DNA,结合形成抗,DNase,的羟基,-,磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；,3,、经,42,短时间热激处理，细胞吸收,DNA,复合物；,4,、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。,（,1,）热激法, CaCl,2,法制备感受态细胞转化,DNA,的原理,10ng,载体,DNA,100,L,感受态细胞,冰浴,30min,42 12min,加入,1mL,LB,培养基,（,Amp,-,）,37,振荡培养,1h,10-100,L,转化液涂,Amp,平板,吸附,DNA,摄入,DNA,操作步骤：,（,p140,）,转化率：,10,6,-10,8,/,g DNA,（,2,）电转化法,原理：,在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组,DNA,通过微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。,实验简单，,不需要制备特殊的感受态细胞,“感受态”：清洗处理，在低温下使细胞处于无离子区且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中，保证电击过程中细胞不被击穿而死亡。,转化率：,10,9,10,10,/,g DNA,（二） 转导,由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程,（三） 转染,噬菌体,DNA,不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感受态细胞捕获的过程。,与转化无本质区别,体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。,每,g,DNA,能形成,10,6,个噬菌斑,现在把,DNA,转移至动物细胞的过程也称转染,体外包装过程,二、重组,DNA,导入真核细胞,（一）导入酵母细胞,原生质体转化,碱金属离子介导的完整细胞转化,PEG1000,转化法,电击法,（二）导入植物细胞,（三）导入动物细胞,1.,利用原生质体进行转化,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl,2,PEG,插入外源基因的载体,共转化：,将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法,转化,转化细胞达原生质体总数的,1%2%,，转化率受再生率影响,共转化的原生质体占转化子总数的,25%33%,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,酵母,0.1mol/L,LiCl,处理,感受态,2. 碱金属离子介导的完整细胞转化,插入外源基因的载体,40%,PEG 4000,热激,涂布选择性平板，筛选转化子,吸收线性,DNA,能力明显大于环状,DNA,，两者相差,80,倍,转化率：,10,3,个,/,g DNA；,共转化现象极少,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,4. 电击转化,（,1,）适于原生质体和完整细胞,（,2,）转化率高，,10,5,个,/,g DNA,（,3,）单链转化率高于双链,3. PEG1000转化,PEG,处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,二、重组,DNA,导入真核细胞,（一）导入酵母细胞,载体介导的转化（农杆菌介导）,DNA,直接导入（基因抢法、电击法等）,种质系统法（花粉管通道法等）,（二）导入植物细胞,（三）导入动物细胞,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,（二）导入植物细胞,1.,农杆菌介导的,Ti,质粒遗传转化方法,将目的基因插入到载体的,T-DNA,区，形成重组,DNA,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,（二）导入植物细胞,1.,农杆菌介导的,Ti,质粒遗传转化方法,将重组,DNA,转入含有,Vir,致病基因的农杆菌,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,（二）导入植物细胞,1.,农杆菌介导的,Ti,质粒遗传转化方法,通过农杆菌侵染植物外植体,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,（二）导入植物细胞,1.,农杆菌介导的,Ti,质粒遗传转化方法,将含有外源目的基因的,T-DNA,整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,在饲养平皿的滤纸上培养2天,叶盘法的具体操作,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将,DNA,分子引入活细胞的转化技术。,DNA,1.2,m,钨弹头,吸附,金属微粒加速，进入受体细胞,基因枪,装入,2. 基因枪法（gene gun）,外植体制备,轰击,外植体培养及选择,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,具体操作,1. DNA微弹的制备,2. 外植体的制备,3. DNA微弹轰击,4. 外植体的培养,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,植物细胞,原生质体,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合入,电击缓冲液,电击处理,愈伤组织,幼苗,分化,3. 电击法（电穿孔法）,选择培养,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,二、重组,DNA,导入真核细胞,（一）导入酵母细胞,1.,磷酸钙沉淀法,2.,脂质体介导法,3.,显微注射法,4. DEAE-,葡萄糖转染法,（二）导入植物细胞,（三）导入动物细胞,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,原理：,（三）导入动物细胞,1.,磷酸钙沉淀法,通过磷酸钙,-DNA,共沉淀，将外源基因导入哺乳动物细胞,依据不同的细胞类型，平皿上最多能有,10%,的细胞能吸收,DNA,沉淀。,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定，但,转染效率低,。,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,2. 脂质体介导法,脂质体包埋,DNA,，通过细胞膜进入细胞。,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,应用玻璃显微注射器，直接把外源,DNA,注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。,3. 显微注射法,1,）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段,2,）收集受精卵：受孕后几小时内,3,）显微注射：将外源基因注入受精卵的,雄原核,4,）受精卵移植,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,二乙氨乙基（,DEAE,）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源,DNA,。,4. DEAE-葡萄糖转染法,葡聚糖,葡聚糖,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,DEAE-dextran,外源,DNA,细胞,混合,DEAE-dextran,对细胞有毒,，常采用低浓度长时间处理,吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分,DNA,可以进入到细胞核里。,4. DEAE-葡萄糖转染法,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,三、转化率及影响因素,转化率（,cfu,/ gDNA,）,：,每微克重组,DNA,转化后，接纳,DNA,分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。,（一）转化率的计算：,转化率 产生菌落的总数,/ DNA,的加入量,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,三、转化率及影响因素,例：取,1l,（,0.1 ng/l,）完整的质粒转化,100l,的感受态细胞。向转化反应液中加入,900l,培养液，让细菌恢复一小段时间，取,100l,铺板。培养过夜，产生,1000,个菌落，转化率为多少？,转化率,1000,/ 0.01 ng DNA = 10,8,cfu /g,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,三、转化率及影响因素,例：某一,DNA,重组实验的重组率为,20%,，转化率为,10,7,cfu / mg,天然载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低,100,倍，欲获得,10,4,个重组克隆，需要投入多少重组载体,DNA,进行重组实验？,10,4,10,7,cfu / mg 10,-2, a 20%,重组载体,a = 0.5 mg,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,三、转化率及影响因素,普通的亚克隆实验,：,110,6,cfu/g DNA,；,更复杂的亚克隆,：,110,7,cfu/g DNA,，如有限量的,DNA,的转化，,T-A,克隆；,构建文库,：, 110,8,cfu/g DNA,。,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,1,）载体,DNA,类型、大小；重组,DNA,浓度、纯度,2,）受体细胞,3,）转化方法：同一转化方法,技术参数,影响转化率,（二）转化率的影响因素,三、转化率及影响因素,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,一、载体表型选择法,二、根据插入基因的表型选择,三、,DNA,电泳检测法,四、,PCR,检测法,五、核酸杂交检测法,六、免疫化学检测法,七、,DNA,序列分析,第三节 重组子的筛选与鉴定,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,1.,抗药性标记及其插入失活选择法,pBR322,质粒上有两个抗性基因,:,Tet,r,和,Amp,r,。,Tet,r,上有插入位点,Bam,H I,和,Sal,I;,Amp,r,上有插入位点,Pst,I,。,一、载体表型选择法,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,2.,-半乳糖苷酶显色反应选择法,-,半乳糖苷酶,X-gal,半乳糖,5-,溴,-4-,氯靛蓝,+,深蓝色,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,-,半乳糖苷酶使,X-gal,分解成蓝色产物。,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,利用插入的外源基因的,表达产物,特性进行直接选择。,转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。,二、根据插入基因的表型选择,1.,弥补缺陷,his,-,his,+,受体菌：,外源基因：,在不含组氨酸的培养基中生长,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,例：抗生素抗性,抗性基因,载体,外源,DNA,连接,转化,受体菌,抗生素培养基平板,含抗生素抗性基因的,克隆才能生长,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,2. 增加新性状,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,1.,直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,三、 DNA电泳检测法,Marker,载体,重组克隆,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,2. 酶切电泳筛选法,根据外源,DNA,序列的限制性酶切图谱，选一两种内切酶切割，电泳后比较电泳结果：,DNA,带数和长度。,一般用重组时的内切酶将外源,DNA,切出,单,双,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,四、PCR扩增检测法,应用,PCR,反应扩增出预期,DNA,片断,（,1,）从重组克隆中提取质粒（或,DNA,）；,（,2,）用外源,DNA,插入片断引物作,PCR,；,（,3,）凝胶电泳；,（,4,）是否有条带产生，条带大小是否正确。,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,五、核酸杂交检测法,1. Southern blotting,从宿主细胞中提取,DNA,，用探针杂交。,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,2. Northern blotting,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主细胞中提取,RNA,，用探针杂交。,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,3. Western blotting,在蛋白质凝胶电泳以后，用,转膜和免疫,的方法检测胶上的蛋白质泳带。,（,SDS-PAGE,）,点样,电泳方向,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,膜,胶,蛋白, 转膜, 杂交,待测蛋白,硝酸纤,维素膜,一抗,二抗, 检测,3. Western blotting,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,4. 原位杂交筛选,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,利用抗体作为“探针”，,检测产生外源,DNA,编码的抗原的菌落或噬菌斑。,六、免疫化学检测法,对表达产物的检测。,蛋白蛋白“杂交”,放射性抗体检测,与菌落杂交相似,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,DNA,测序是最为准确的重组子鉴定方法，可以鉴定重组克隆序列是否准确无误。,七、DNA序列分析,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,（,1,）大肠杆菌的,-D-,葡萄糖醛酸糖苷酶,（,-D-glucuronidase,，,GUS,）；,（,2,）细菌和萤火虫的,荧光素酶,（,Luciferase,）；,（,3,）水母绿色荧光蛋白（,GFP,）基因 （,Green Fluorescent Protein,）。,植物转化体报告基因（reporter gene)筛选,报告基因：,基因载体上引入的一些可证明载体已经进入宿主细胞，并可将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来的具有特殊标志意义的基因。,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,（,1,）,获得目的基因,；,（,2,）目的基因与载体的酶切与连接；,（,3,）将目的基因导入受体细胞；,（,4,）转化受体细胞的大量繁殖；,（,5,）目的基因的检测和表达。,进行基因工程操作的一般步骤,?,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,1,、什么是感受态细胞？简述,CaCl,2,法制备感受态细胞转化,DNA,的原理 ？,2,、什么是,Ti,质粒？简述农杆菌介导的,Ti,质粒遗传转化方法。,3,、重组子筛选主要有哪些方法 ？,思 考 题,何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件,