基因工程yingyong

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,1.1 DNA,重组技术的基本工具,2024/9/20,1,基因工程的概念：,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外,DNA,重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在,DNA,分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做,DNA,重组技术或基因拼接技术。,2024/9/20,2,考点一对基因工程概念的理解,基因工程的别名,基因拼接技术或,DNA,重组技术,操作环境,生物,体外,操作对象,基因,操作水平,DNA,分子水平,基本过程,剪切拼接导入表达,结果,定向改造,生物的遗传性状，创造出新的生物类型,3,考点,2,基因工程的理论基础,1.,基因拼接的理论基础,（,1,）,DNA,是主要的遗传物质；,（,2,）,DNA,的基本组成单位都是四种脱氧核糖核苷酸；,（,3,）,DNA,双螺旋结构。,4,2.,外源基因表达的理论基础,（,1,）基因是控制生物性状独立遗传的单位；,（,2,）遗传信息的传递都遵循中心法则；,（,3,）生物界共用一套遗传密码。,3.,技术支持：,基因转移载体的发现；工具酶的发明；,DNA,体外重组的实现；重组,DNA,表达实验的成功。,5,基因工程需要哪些基本工具,?,2024/9/20,6,培育抗虫棉需要哪些工具？,分子手术刀,限制性核酸内切酶,分子缝合针,DNA,连接酶,分子运输车,载体,2024/9/20,7,一、分子手术刀,-,限制性核酸内切酶,(,限制酶）,2024/9/20,8,2024/9/20,9,内切酶切割,DNA,后形成的末端,黏性末端、平末端是如何形成的？,2024/9/20,10,什么叫黏性末端？,2024/9/20,11,什么叫平末端？,2024/9/20,12,大肠杆菌的一种限制酶（,EcoR),能识别,GAATTC,序列，并在,G,和,A,之间切开形成黏性末端。,Sma,能识别,CCCGGG,序列，并在,C,和,G,之间切割形成平末端 。,2024/9/20,13,识别双链,DNA,分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中,特定部位,的两个核苷酸之间的,磷酸二酯键,断开。,主要是从,原核生物,中分离纯化出来的酶。,4000,种。,1,、来源：,2,、种类：,3,、作用：,4,、结果：,形成两种末端,一、 “分子手术刀”,限制性核酸内切酶,黏性末端,平末端,2024/9/20,14,寻根问底,:,限制酶存在于原核细胞中的作用是什么？为什么限制酶不剪切细菌本身的,DNA,？,2024/9/20,15,怎样理解限制酶和,DNA,连接酶在微生物中能够分离到,而高等植物和动物中没有,?,2024/9/20,16,为什么限制酶不能将自己的,DNA,分子剪切掉？,DNA,分子不具备该种限制酶的识别切割序列；或序列被修饰。,2024/9/20,17,1.,原核生物容易受到自然界外源,DNA,的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源,DNA,侵入时，会利用限制酶将外源,DNA,切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源,DNA,、使之失效，从而达到保护自身的目的。,2.,迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断,DNA,上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身,DNA,，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的,DNA,可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其,DNA,分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的,DNA,被切断，并且可以防止外源,DNA,的入侵,.,2024/9/20,18,二、连接酶,“,分子缝合针,”,.,作用：连接磷酸二酯键,2024/9/20,19,限制酶切割后产生两种不同的末端。那么恢复它们的连接时，所用,DNA,连接酶是否可以不加选择？,E.coliDNA,连接酶：连接黏性末端,T,4,DNA,连接酶：连接黏性末端和平末端,.DNA,连接酶的种类,2024/9/20,20,DNA,聚合酶和,DNA,连接酶有何相同点和不同点？,2024/9/20,21,答：不是一回事。,DNA,连接酶和,DNA,聚合酶都是形成磷酸二酯键，那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？,（,1,）,DNA,聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的,3,末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而,DNA,连接酶是在两个,DNA,片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与,DNA,片段之间形成磷酸二酯键。,（,2,）,DNA,聚合酶是以一条,DNA,链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的,DNA,链；而,DNA,连接酶不需要模板。,此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。,2024/9/20,22,假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？,作为载体没有切割位点将怎样？,目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？,如果载体对受体细胞有害将怎样？,三、基因进入受体细胞的载体,“,分子运输车,”,2024/9/20,23,载体的必要条件,1,、能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；,2,、有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接；,3,、有标记基因位点，以便重组后进行筛选。,2024/9/20,24,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别。,2024/9/20,25,常用的分子运输车有哪些？,质粒、,噬菌体衍生物、,动植物病毒,2024/9/20,26,2024/9/20,27,小结,基因工程,的工具,限制酶,主要存在于原核生物中,具有专一性,(,识别序列,),切开,DNA,分子的磷酸二酯键,DNA,连,接酶,连接磷酸二酯键,种类,E.coliDNA,连接酶,T,4,DNA,连接酶,载体,具备的,条件,自我复制,具一个多个限制酶切位点,具标记基因,大小适中,质粒、,噬菌体衍生物、动植物病毒,对受体细胞无害,2024/9/20,28,思考与探究,总结规律,限制酶所识别的序列有什么特点？,无论是,6,个碱基还是,4,个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链,DNA,上的碱基是反向对称重复排列的。,1.,限制酶在,DNA,的任何部位都能将,DNA,切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的,DNA,片段：,(1),CTGCA,(2),AC,(3) GC,G,TG,CG,（,4,）,G,(5),G,(6),GC,CTTAA,ACGTC,CG,(7) GT,(8)AATTC,CA,G,你是否能用,DNA,连接酶将它们连接起来？,2024/9/20,29,2,和,7,能连接形成,ACGT,TGCA,；,4,和,8,能连接形成,GAATTC,CTTAAG,；,3,和,6,能连接形成,GCGC,CGCG,；,1,和,5,能连接形成,CTGCAG,GACGTC,。,2024/9/20,30,3.,基因工程中作为载体使用的,DNA,分子很多都是质粒（,plasmid,），即独立于细菌拟核处染色体,DNA,之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的,DNA,分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。,（,1,） 载体,DNA,必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。,（,2,） 载体,DNA,必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体,DNA,上随染色体,DNA,的复制而同步复制。,（,3,） 载体,DNA,必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。,（,4,） 载体,DNA,必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。,（,5,） 载体,DNA,分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。,实际上自然存在的质粒,DNA,分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,2024/9/20,31,4.,网上查询：,DNA,连接酶有连接单链,DNA,的本领吗？,迄今为止，所发现的,DNA,连接酶都不具有连接单链,DNA,的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链,DNA,的酶。,2024/9/20,32,1.,在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的,DNA,片段，需使用（ ）,同种限制酶,B.,两种限制酶,同种连接酶,D.,两种连接酶,A,练习,2024/9/20,33,2.,不属于质粒被选为基因运载体的理由是,A,、能复制 （ ）,B,、有多个限制酶切点,C,、具有标记基因,D,、它是环状,DNA,D,2024/9/20,34,3.,基因工程是在,DNA,分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ）,A,、目的基因的获取,B,、基因表达载体的构建,C,、将目的基因导入受体细胞,D,、目的基因的检测与鉴定,C,练习,2024/9/20,35,谢谢,2024/9/20,36,问题,:,DNA,聚合酶与,DNA,连接酶是同一种酶的不同名称吗,?,相同,区别,DNA,聚合酶,形成磷酸二酯键,只能将单个核苷酸连接到核酸片段上,;,以一条,DNA,链为模板,形成互补的,DNA,链。,DNA,连接酶,将两个,DNA,片段之是形成磷酸二脂键；,将,DNA,双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板。,2024/9/20,37,问题：标记基因的作用及其应用,标记基因,抗四环素的基因,抗氨苄青霉素的基因,特定颜色的基因,四环素,氨苄青霉素,2024/9/20,38,习题,:,已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因,现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么,?,请设计实验、写出可能的实验结果，并得出相应的实验结论,对照组：不添加抗生素,实验组,1,：添加一定浓度的四环素,实验组,2,：添加一定浓度的氨苄青霉素,实验组,3,：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素,对照组,实验组,1,实验组,2,实验组,3,结 论,结果一,+,+,+,+,既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因,结果二,+,+,只含有抗四环素基因,结果三,+,+,只含有抗氨苄青霉素基因,结果四,+,既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因,2024/9/20,39,载体的三大功能：,1,）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。,2,）为外源基因提供在受体细胞的的复制能力或整合力。,3,）为外源基因提供在受体细胞的的扩增和表达能力。,理想载体具备四个条件：,1),具有对受体细胞的可转移性，提高导入细胞的效率。,2),具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，使外源基因在受体细胞中稳定遗传。,3),具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，有利于外源基因的拼接插入。,4),具有合适的选择标记（报告基因），便于,DNA,重组分子的检测。,问题,:,为什么需要载体,直接将基因导入受体细胞行不行,?,2024/9/20,40,质粒的构建与改造,1),删除不必要的,DNA,区域，缩小分子量，提高外源,DNA,片段装载量。,2),灭活某些质粒的编码基因。,3),加入易于识别的选择标记基因。,4),加入特殊的基因表达调控元件。,一般来说，天然运载体往往不能满足人类的所有要求，因此人们根据不同的目的和需要，对某些天然的运载体进行人工改建。,2024/9/20,41,（,08,海南高考）,右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制酶,Eco,R,、,Bam,H,的酶切位点，,amp,R,为青霉素抗性基因，,tct,R,为四环素抗性基因，,P,启动子，,T,为终止子，,ori,为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括,Eco,R,、,Bam,H,在内的多种酶的酶切位点。据图回答。,（,1,）,将含有目的基因的,DNA,与质粒分别用,Eco,R,酶切，酶切产物用,DNA,连接酶进行连接后，其中由两个,DNA,片段之间连接形成的产物有,、,、,3,种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行,。,（,2,）用上述,3,种连接产物与无任何抗药性的原核受体细胞进行转化实验。之后将这些受体细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核受体细胞所含有的连接产物是,；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核受体细胞所含有的连接产物,。,（,3,）目的基因表达时，,RNA,聚合酶的识别和结合位点是,，其合成产物是,。,（,4,）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是,。,（,1,）目的基因载体连接物,载体载体连接物,目的基因目的基因连接物,分离纯化,（,2,）载体载体连接物,目的基因载体连接物、载体载体连接物,（,3,）启动子,mRNA,（,4,）,Eco,R,和,Bam,H,2024/9/20,42,