实验一二三四----DNA重组技术

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验一二三四-DNA重组技术,碱裂解法小量制备质粒,DNA,一实验目的及背景,质粒是染色体外的,DNA,分子，大小可为,1kb,到,200kb,。,大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。,其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。,质粒的应用,质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。,本,实验目的,本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。,分离质粒,DNA,方法,从大肠杆菌中分离质粒,DNA,方法众多，目前常用的,碱变性法；,煮沸法；,SDS,法；,各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒,DNA,可用于酶切,连接与转化。,1. 溶菌酶,2.,碱裂解：,SDS, NaOH,3.,中和：,pH 4.8,醋酸钠,溶菌，释放,DNA,蛋白质、,DNA,变性,中和、质粒,DNA,复性,碱变性法基本原理,碱变性法基本原理,在,碱性,环境中，线性的大分子量细菌染色体,DNA,变性，而共价闭环质粒,DNA,仍为自然状态。,将,PH,调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体,DNA,之间交联形成不溶性网状结构，大部分,DNA,和蛋白质在去污剂,SDS,的作用下形成沉淀，而质粒,DNA,仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体,DNA,、,RNA,及蛋白质，质粒,DNA,尚在上清中，再进一步纯化质粒,DNA,。,实验方法,挑取琼脂培养板上的单菌落至,5ml LB,培养液中（含,AmP 50g/ml,）， ,强烈摇荡过度。,取,1.5ml,培养液至,Eppendorf,管中，,12000g,离心,30,秒，弃上清,将细菌沉淀悬浮于,250l,预冷溶液,（已加入,RNA,酶）中，振荡混匀。,加入,250l,溶液,，盖严管盖轻柔颠倒次以混匀内容物。,加入,350l,溶液,，温和颠倒数次。,12000g,离心,8,分钟，取上清移到吸附柱中离心,1,分钟。,加入,700l 70%,乙醇，,000g,离心,1,分钟。,8 .,重复,7,9 .,000g,离心,2,分钟,10,加入,50l,洗脱液至吸附膜中央，,000g,离 心,1,分钟。,11,取,10l DNA,溶解液加,2l Loading buffer,于,1%,琼脂糖电泳。,12,电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察。,注意事项,1. 菌浓度，,OD,值,2.,P1,充分重悬菌体沉淀,3.,P2,裂菌时间不超过5,min，,动作温和。,4. 洗涤后充分离心,的酶切,一实验目的及背景,核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来的侵袭。,限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的片段端为，端为。,限制酶,根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为,、,、,型三大类。,类和,类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖,ATP,的限制性内切酶活性。,类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。,类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。,故,类和,类酶在基因工程中基本不用。,型酶,型酶就是通常指的限制性内切酶,.,它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段；,型酶分子量较小，仅需,Mg2+,作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；,型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出；端突出和平末端。,正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。,酶切反应注意事项：,内切酶：,不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；,内切酶的用量 根据内切酶单位和用量而定，通常,1u,指在适当条件下，,1,小时内完全酶解,ug,特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以,ug DNA,对,u,酶短时间为宜。,同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；,内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。,：,作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、,SDS,、,EDTA,、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。,这种抑制可通过：,增加酶作用单位数（,1020U/ug DNA,）、,增大反应体积以稀释可能的抑制剂,或延长反应时间加以克服。,反应缓冲液：,反应缓冲液主要由,TrisHCl,、,NaCl,、,Mg,2,+,组成，其中,Mg,2,+,为内切酶辅基；,TrisHCl,维持反应体系,pH,值在之间；,NaCl,浓度不同形成种级别的离子强度：,低盐（,10mM NaCl),中盐（,50mM NaCl,）,高盐（,100mM NaCl,）,不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。,酶解温度与时间：,大多数限制酶反应温度为,，如,EcoR, Hind, BamH, Pst,等，也有如,Bcl,需在,下进行反应，,反应时间根据酶的单位与用量之比来定。一般小时即可充分酶解。,质粒 5-8,l,10,buffer 1.5 l,15l,体系中,E1 0.25 l,E2 0.25 l,ddH,2,O：,5-8 l,1.,酶切体系,步骤,将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。,Eppendorf,管于,水管中反应小时。,反应结束后加入,Loading buffer,终止反应。,取,5l,于琼脂糖凝胶上电泳。,紫外透射仪上检查实验结果。,琼脂糖凝胶,电泳,原理,1.,DNA、 RNA,的多核苷酸链中的磷酸基团,呈离子化状态，带负电. 磷酸戊糖重复性,决定了迁移速率取决于分子的大小和构型.,2.不同浓度的琼脂糖凝胶介质分离分子量,大小不同的,DNA,片断,3.,EB,显色 !,琼脂糖凝胶,电泳,试剂,1,、 5,TBE（5,倍体积的,TBE,贮存液）,配1000,ml 5TBE：,Tris,54g,硼酸 27.5,g,0.5mol/l EDTA 20ml（pH 8.0）,2、,凝胶加样缓冲液（6）,溴酚蓝 0.25%,蔗糖 40%,3、 琼脂糖,4、 溴化乙锭溶液（,EB） 0.5g/ml,琼脂糖凝胶,电泳,步骤,（一）制备琼脂糖凝胶,称取0.3,g,琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30,ml 0.5TBE,缓冲液，,置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液，,按100,ml,的凝胶加5,l,的,EB。,（二,）,胶板的制备,1.将有机玻璃槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。,2. 将冷到60左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。,3.待胶凝固后，加入电泳缓冲液至电泳槽中。,4.取出梳子。,（三,）,加样,（四）电泳,DNA,的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5,V/cm。,当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12,cm,处，停止电泳。,琼脂糖凝胶浓度/% 线性,DNA,的有效分离范围/,kb,0.3 560,0.6 120,0.7 0.810,0.9 0.57,1.2 0.46,1.5 0.24,2.0 0.13,注意事项,合适的凝胶浓度,正确的电泳方向,琼脂糖凝胶,电泳,胶回收,步骤,1.切胶,称重,2.溶胶,3.过柱,4.洗涤,5.洗脱,注意事项,核酸的体外连接,原理,T,4,噬菌体,DNA,连接酶：粘性末端的,DNA,分子连接,平末端的双链,DNA,分子连接,连接体系：,线性化载体 2,l,片断 6,l,10,ligase buffer 1l,T,4,ligase 1l,12-16, 过夜,1、,DNA,连接酶用量与,DNA,片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。 2、在连接带有粘性末端的,DNA,片段时，,DNA,浓度一般为2-10,mg/ml，,在连接平齐末端时，需加入,DNA,浓度至100-200,mg/ml。 3、,连接反应后，反应液在0储存数天，-80储存2个月，但是在-20冰冻保存将会降低转化效率。 4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管,T4 DNA,连接酶的最适反应温度为37，在连接粘性末端时，反应温度以10-16为好，平齐末端则以15-20为好。 5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5磷酸基处理，使用过量的外源,DNA,片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源,DNA,和载体连接的机会。,注意事项,核酸的体外连接,大肠杆菌感受态细胞 的制备和转化,一实验目的及背景,转化,(Transformation),是将外源,DNA,分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。,所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。,学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法，并通过转化的方法导入,DNA,。,实验原理,在进行基因克隆时，体外构建的,DNA,重组子必须导入合适的受体细胞，才可以复制，增殖和表达。载体与外源目的基因构成的重组载体可以通过转化直接导入受体细胞，从而实现基因在异源细胞的表达。进行转化时，要求细胞处于容易吸收外源,DNA,的状态，即感受态，重组分子才能进入细胞内。,通过,CaCl,2,处理的大肠杆菌细胞就是一种感受态细胞。在,0,冷冻处理时，处于,CaCl,2,低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。,DNA,可吸附于其表面。在短暂的热冲击下，细胞吸收外源,DNA,，然后在丰富培养基内复原并增殖，表达外源基因。,带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内可表达时，受体细胞表现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。,材料、试剂及器具,1,、 材料,E.coli DH5,转化产物,2,、 试剂,（,1,）,0.1mol/L CaCl 2,（灭菌）。,（,2,）,LB,液体培养基、固体培养基。,（,3,）氨苄青霉素（,Amp,）：用无菌水配制成,100mg/mL,溶液，置,-20,冰箱保存。,3,、器具,（,1,）超净工作台。,（,2,）恒温水浴锅。,（,3,）恒温摇床、培养箱。,操作步骤,感受态细胞的制备从大肠杆菌,DH5,的培养平板上挑取一个单菌落接于,2mLLB,液体培养基的试管中，,37,振荡培养过夜。以,1%,的接种量将以上过夜培养物接种于液体培养基中,37,振荡培养,2,3h,将菌液转移到,1.5mL,离心管中，冰上放置,10min,4000rpm,，离心,10min,回收细胞用冰冷的,0.1mol/L CaCl 2 1mL,，悬浮沉淀立即放在冰上保温,30min4,，,4000rpm,，离心,10min,，回收细胞用冰冷的,0.1mol/L CaCl 2 0.1mL,悬浮细胞（务必放冰上）分装细胞，每,100l,一份。此细胞为感受态细胞,质粒/连接产物的转化,在,100l,新鲜配制的感受态细胞中加入连接产物，,冰上放置,30min,将管放到,42,循环水浴热冲击,90s,取出，迅速冰浴,2min,每管加,400l LB,液体培养基，,37,慢摇复苏40,min,3000rpm,，离心,5min,回收细胞,吸弃450,l,上清后，轻轻重悬细胞，全部铺平板，待菌液干燥后倒置培养皿，于,37,培养过夜,次日观察，并记录转化情况，计算转化率（转化子数,/gDNA,）。,细胞生长状态和密度,质粒的质量和浓度,:,1ng,的,DNA,即可使,50l,的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA,溶液的体积不应超过感受态细胞体积的,5,。,试剂的质量,:,所用的试剂,如,CaCl2,等均需是最高纯度的,(GR.,或,AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。,为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：,