基因工程周岩基因工程载体

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 基因工程载体,1,作为一个理想的载体，应具备以下条件：,载体：,这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的,DNA,大分子称之为载体（,vector,）。,（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；,（2）具有多种限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源 DNA 片段插入其中；,（3）具有容易检测的筛选标记；,（4）载体 DNA 的分子量适当，可容纳较大的外源DNA 片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；,（,5,）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。,2,第一节 微生物基因工程载体,克隆载体（clone vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和 cDNA 文库，其上有复制子即可；,表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子；,穿梭载体（shottle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。,3,一、质粒载体,1.,严紧型和松驰型质粒,严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有 13个。,松驰型质粒：其拷贝数较多，一般 2060 个，多的可达 200300 个。,4,2、转移型和非转移型质粒,转移型，结合型（,conjugative plasmid,）：是指一些质粒在不同的菌株中可以相互转移。,非转移型质粒,(non-conjugative plasmid)：,则只能在一种寄主中生存,。,5,3.,质粒的不相容性和不亲和群,质粒的不相容性：一般地，不同质粒不能共处在一个细胞中，这种特性称质粒的不相容性，当它们处在一起时，便有生存竞争，结果一种质粒繁殖，另一种逐渐被排斥，数目变少。,不亲和群：彼此不相容的质粒组成一个不亲合群。,6,（二）质粒的命名,1. 人工组建的质粒,人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的第一个字符 p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。,例：pXYp109；pSC101等,天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号括起来。如（,ColE1,）；农杆菌质粒用,p,加,Ti,（,Tumer inducing,）或,At,（,Agrobacterium tumefacions,）表示，如,pTiC58,。,2. 天然载体质粒,7,（三）常用质粒载体,1. pSC101,图,8,2. pBR322,（1）组成,它由三部分组成：,来自,pSCl01,的四环 素抗性基因,Tet,r,来自,ColEl,的衍生物,pMBl,的松弛复制起点,ori,来自,RSF2124,的氨苄青霉素抗性基因,Amp,r,。,9,（2）特点,具有多个单一的限制性内切酶位点。,Tet,r,中有,BamH1,切点（,G,GATCC,）和,Sal,切点（,G,AATTC,），,Amp,r,中有,Pst,切点（,CTGCA,G,）。,利用 ColEl 的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒拷贝数进一步扩增。,10,（3）,重组克隆的,“插入失活”筛选方法,pBR322外源基因插入在 Tet,r,中，基因型为Tet,s,、Amp,r,在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长；,pBR322外源基因插入在Amp,r,中，基因型为Tet,r,、Amp,s,、在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在在含有四环素培养基可生长；,而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。,这种在一个基因位点中插入外源,DNA,片段，从而使该基因活性丧失的现象叫,插入失活,。,11,Amp,r,Tet,r,Tet,r,Amp,s,PstI,.,.,.,.,.,.,.,.,涂布有Tet的培养基,涂布有Amp的培养基,.,.,.,.,.,.,重组体的筛选,外源基因的插入：,.,12,3、,pUC,系列质粒载体,（1）特点,具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷贝数。,具有多克隆位点,13,可用组化方法鉴别：,可通过插入失活法进行筛选,含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的,LacZ,基因（,LacZ,），它编码-半乳糖苷酶氨基端,146,个氨基酸,，可以和,-半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补，即,互补 ，恢复分解乳糖的能力。,X-gal,也是,-,半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无,-,半乳糖苷酶时，,X-gal,不被分解，菌落呈白色。,当外源基因插入到pUC质粒的LacZ,基因内部，则LacZ,基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的,-,半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重组体为蓝色菌落。,含Amp,r,抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛选。,14,lacZ,lacZ,N端 C端,缺陷型大肠杆菌,完整的,-半乳糖苷酶,15,（四）大肠杆菌中的表达载体,表达载体应含有：,（1）强启动子,（2）在启动子下游区和 ATG 上游区有一个好的SD序列。,（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。,16,二、,噬菌体载体,（一）,噬菌体载体,1、,噬菌体载体的特征,噬菌体颗粒中,DNA,为线状双链,DNA,分子，全长,48502 bp,，两端各有一段长度为,12,个核苷酸的互补单链（粘端），称为,cos,位点。噬菌体有 61 个基因，其中有 1/3 的区域是其裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源 DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是噬菌体可作为基因载体的依据 。,17,18,GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA,T,A,C,G,环化作用,19,2、,噬菌体的缺陷与改造, 基因组太大（49kb）；, 酶切点太多，它有5个,Bam,H1位点（GGATCC），6个Bg位点（AGATCT），5个,Eco,R位点（GAATTC）。,野生型只能接纳一定长度的,DNA,。若相当于,噬菌体的,75-105%,，那么只能接纳,49kb,5%=2.45 kb,的,DNA,。,噬菌体的缺陷：,20,噬菌体的改造, 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；, 去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；,增加标记基因（,remarke gene,）。,21,3. ,噬菌体的主要类型,（,1,）插入型载体,只有1,2,种限制性核酸内切酶的单一切割位点,免疫功能失活,大肠杆菌,-,半乳糖苷酶失活,22,（2）,替换型载体,在其中央部位有一个可以被外源插入的,DNA,分子取代的,DNA,片段的克隆载体,。这是由于构建此载体时，安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列，因此，当外源,DNA,插入时，一对克隆位点之间的,DNA,片段便会被置换掉，从而有效提高了克隆外源,DNA,片段的能力。,23,（二）,M13,噬菌体载体,M13,噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状正链,ssDNA，6407 bp,，其中,90%,的,DNA,都编码蛋白质，有,10,个基因，有两个较长的间隔区，是外源基因插入的部位。,24,M13 噬菌体产生单双链 DNA 的机制,1、以（+）链 DNA为摸板，,合成互补（）链，该双链称复制型,DNA（RFDNA）。,2、RFDNA,在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约,200,个拷贝。,3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链 DNA 。,4、游离出来的（+）链 DNA 先与基因V的编码产物形成特异的 DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA 链上脱落下来，余下的 M13（+）链 DNA 则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。,25,+,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,单链结合蛋白,RF型DNA,复制约200copy,+,+,+,+,+,以,-,链DNA为模板合成+链DNA,26,三、噬菌粒载体（科斯质粒，cosmid,）,1、构建,由质粒和,噬菌体的粘性末端构建而成的。借用,cos-,（粘性尾巴）作字头，质粒的,-mid,作字尾，故称,Cosmid,，也叫粘粒载体。,2、特点,（1）,有,噬菌体的高效感染能力。,（2）有质粒的高效复制特性。,（3）有更广泛寄主。,（4）有较大的容量。,27,四、酵母菌载体,多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链,DNA,，称为,2,质粒，长约,6.3 kb,，有单一的复制起始点和一个自主复制功能区域（,ARS,片段）。,根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、附加型和稳定型等类型。,28, 含有,E.coli,质粒的复制起始序列，这样在外源基因转化到酵母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。, 含有酵母的筛选标记，这样当重组质粒转入相应的酵母细胞后，可用来筛选重组体。, 具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。,共同的特点：,29,整合型：,含有酵母的筛选标记,ura3,，但不具有酵母的复制起始点该质粒 DNA 以单拷贝形式稳定遗传，缺点是转化率较低（110 转化子/g DNA）.,复制,型：,是酵母,DNA,片段插入到大肠杆菌质粒中构成的，插入片段含有酵母的筛选标记,ura3,和,2u DNA,片段，一般以低拷贝数维持在酵母染色体之外。复制型载体对酶母的转化率极高（,10,2,10,3,转化子,/,g DNA,），但是转化子不稳定，容易丢失。,30,附加型：,是在,pBR322,中插入酵母筛选标记和,2uDNA,的,ARS,序列构建成的。这种质粒以附加体的形式存在于真核细胞中。附加型型载体对酵母具有很高的转化活性（,10,2,10,3,转化子,/,g DNA,），且与复制型相比，稳定性高，拷贝数也较高（,25,100,分子,/,细胞）。,稳定型：,在附加型载体中再插入酵母着丝粒的一个,DNA,片段（,CEN,）。,31,第二节,植物基因工程载体,一、根癌农杆菌及,Ti,质粒,（一）根癌农杆菌与冠瘿瘤,根癌农杆菌属根瘤菌科农杆菌属，通过伤口可感染双子叶植物，并在创伤部位使组织恶性增生而形成植物肿瘤，叫冠瘿瘤（crown gall tumor）。,冠瘿碱,类植物激素,章鱼碱,胭脂碱,农杆碱,32,（二）Ti质粒及 T-DNA 的结构与功能,Ti,质粒是农杆菌非染色体的环状双链,DNA,分子，分子量为,90,10,6,150,10,6,道尔顿，有,160240 kb。,致病菌株,37,培养,治愈菌株,（Ti 质粒被消除）,治愈菌株,与致病菌株接合,致病菌株（重新获得Ti质粒）,33,1. T-DNA 区,胭脂碱型质粒,T,区大小约,23 kb,，单一序列插入植物核,DNA。,章鱼碱型,左区,(TL-DNA)：,长约,13 kb,，通常为单拷贝，有诱发和维持肿瘤的作用。,右区,(TR-DNA)：,长约,7kb,，多拷贝,含有参与冠瘿碱生物合成的蛋白酶的编码基因。,34,图,章鱼碱pTiAch5和胭脂碱pTiC58质粒的遗传图,35,共同区：,T,区有控制肿瘤形态和编码冠瘿碱合成酶基因，实际上,shi,基因与生长素合成有关。,roi,基因与细胞分裂素合成有关，,Ocs,是章鱼碱合成酶基因，,Agr,是编码农杆碱合成酶基因，章鱼碱型与胭脂碱型的,T,区中上述基因分布不完全一致，但,90,是相同的称共同区。,3,个同源区段，含有,6,个基因位点，是冠瘿瘤形成所必需的，统称“致癌基因”,(oncogene,，,onc),。,非同源序列则编码冠瘿碱合成酶，在胭脂碱型中叫,Nos,，章鱼碱型酶叫,Ocs,。,共同区,36,已知 T-DNA 的两侧是被一对保守的 25 bp 的重复序列包围着，而且在一系列不同的植物肿瘤DNA 中发现，T-DNA 的两边端点是位于这种同向重复序列的当中或附近，这种同向重复序列实际上就是T-DNA 的边缘区。,右侧边缘区又叫,RB,序列，左侧边缘区又叫,LB,序列。,37,2、,毒性,Vir,区,VirA,、,B,、,D,和,G,为致瘤性，它们的突变型为非致病性。,VirA,、,C,、,D,编码专一核酸内切酶蛋白，与,VirB,共同作用，与,T-DNA,迁移直接有关。,VirC,部分决定寄主范围,VirE,与菌体感染过程有关,Vir,区大约,35 kb,，包含,6,个互补群，,A,、,B,、,C,、,D,、,E,、,G,。,38,3、,代谢区,Tra,，,T-DNA,转移功能；,Agr,，农杆碱代谢；,Inc,，不同类型质粒代谢相容性；,Occ,和,Noc,，章鱼碱和胭脂碱分解代谢。,39,（三）农杆菌对寄主的侵染和,T-DNA,的转移,1、侵染过程,2、T-DNA 的转移,（1）创伤植物细胞释放出可激活Ti质粒 Vir 基因进行转录的蛋白因子；,（2）VirA 和 VirD 蛋白因子进一步激活其它的 Vir 基因进行表达；,（3）先在Ti质粒右侧边缘区产生出头一个单链缺口；,（4）接着在 Ti 质粒左侧边缘区产生出另一个单链缺口，结果释放出的单链 T-DNA 分子便定向地转移到植物细胞，并随机整合到寄主染色体基因组上；,（5）Ti 质粒中移走的单链 T-DNA 区，通过 DNA 复制得到修复。,40,（四）Ti,质粒作为植物基因工程的载体,1、可行性,（1）将细菌转座子,Tn7,插入胭脂碱合成酶基因（,Nos,）位置上，该,Ti,质粒仍能实现,T-DNA,转移。,（2）用,Cat,与 Nos 和 Ocs 基因启动子拼接后，重组进入,Ti,质粒，,Ti,质粒感染植物，植物细胞中检测到了,Cat,基因的酶的存在。,41,（1）转化植物细胞很难形成完整植株。,（2）质粒上分布着多个酶切位点，而不是单一切点，酶切后不易成环，给插入目的基因带来困难。,（3）Ti,质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，可农杆菌对,Ti,的转化率太低，只有,10,9,10,7,左右,。,2、存在缺陷,42,（五）Ti,质粒的改造,1、,去除致瘤基因,Onc,由于影响植株再生的直接原因是,T-DNA,中的,Onc,基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的质粒，记为,Onc,，这个过程叫“卸甲”、,“缴械”或“解除武装”，构建的,Onc,载体叫“卸甲载体”,。,例：pGV3850,43,2、,共整合质粒,（1）首先构建中间载体，如将大肠杆菌,pBR322,质粒带上一段与,Ti,质粒,T,区同源的一个片段，它在大肠杆菌和农杆菌中均能复制；,（2）然后将目的基因插入该片段的适当位置，这样使目的基因两端带上了与,Ti,质粒,T-DNA,同源的,DNA,序列；,（3）然后再将该质粒通过转化或接合引入含有,Ti,质粒的农杆菌中。,（4）引入的衍生质粒和原细胞中,Ti,质粒具同源性，因而可产生无性配对重组，通过交换，可将目的基因转到,Ti,质粒上，使之产生真正的具有外源基因的,Ti,质粒，称共整合质粒。,44,3、,双元载体,“双元载体”,，,也称反式载体，是指由两个分别含,T-DNA,和,Vir,相容性,Ti,质粒构成的双质粒系统。,含有为,T-DNA,转移所必须的,Vir,区的质粒，,另一个则是含有,T-DNA,区段的寄主范围广泛的,DNA,转移载体质粒，后一种质粒较小，可在大肠杆菌中复制，因而易操作，可用来插入外源基因。,4、,载体盒,所谓“载体盒”,(Vector cassette),是将植物的标志基因、多插入位点、细菌标志基因和质粒的复制启动子位点等集于一身的质粒系统，象一个集装箱似的集合在一起。,45,二、,Ri,质粒载体,三、,CaMV(,花椰菜花叶病毒,),载体系统,Ri,质粒其结构和功能与,Ti,十分相似,。,与Ti质粒相比的优点：可以构建完整的 Onc+ 载体。,花椰菜花叶病毒,(caulimovirus,，简称,CaMV),实际上是一个病毒群，已知有,12,个种，每个种的寄主范围都很窄，不感染豆类和单子叶植株，它的主要寄主是芸苔属。,CaMV DNA 有两个特别之点，一是在专一位点有不连续性，DNA 链上有一处到三处不连续；另一点是在电镜下观察到 DNA 大部分有盘绕结构，看上去似超螺旋。,46,47,48,1、,互补载体系统,2、混合载体系统,缺陷性,CaMV,+ 辅助病毒分子,将,CaMV DNA,克隆到了,Ti,质粒上，通过农杆菌导入植物细胞，可产生典型的病毒感染症状。,3、CaMV35S,启动子融合基因载体系统,SalI Km,r,SalI,SalI,Ti质粒T- DNA区,SalI Km,r,SalI,混合载体构建过程,SalI,SalI,SalI,49,四、脂质体(liposomes)载体,（一）、脂质体结构与性质,脂质体是磷脂在水中形成的一种由脂双分子层围成的囊状结构，这种结构是一种分子排列有序的近晶型液晶。,脂质体的主要成分是磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺等。,制备方法：,有超声波法、机械振荡法、透析法、融合法以及逆向蒸发法等。,50,51,（二）,脂质体与细胞的相互作用,脂质体作为载体的机理:,与细菌球质体的作用是相似的，它能将,DNA,包埋在里边，在,PEG,诱导下，通过细胞的吞噬或融合作用将内含物转入受体细胞，最终与受体核,DNA,结合。,脂质体与细胞的相互作用主要有以下几种形式：,1. 内吞作用,2.,融合作用,3.,交换作用,优点：,使包装在里边的物质（质粒或,DNA,）能避开核酸酶的降解，对受体无毒性，易被吸收，运送率高，转化率高。更重要的是脂质体制备比常用的质粒载体要容易得多，价格低廉，技术操作也简单得多。,52,第三节 动物基因工程载体,整合型：,即外源基因通过这种病毒载体整合到宿主细胞的染色体上，随着宿主细胞基因组的复制而扩增。,游离型：,或称病毒颗粒型，携带有外源基因的这类载体，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗粒的形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒的存在下进行复制。,53,一、SV40,1、SV40 基因组,其基因组为共价闭合环状双链,DNA,，只有,5243,个碱基对。,早期基因：产生 T 和 t抗原,复制起点（,ori,）,晚期基因：转译出壳蛋白VP1、VP2、VP3,54,2、SV40 的复制和增殖,（1）SV40 感染敏感的猿猴细胞后，经过 8,12 小时的潜伏期，脱去外壳，DNA 进入细胞核。,（2）首先启动早期转录，在细胞质中翻译产生 T和 t 抗原。,（3）当两种抗原积累到足够量时，DNA 开始复制，同时启动晚期转录，翻译产生壳蛋白，将DNA 包装成病毒颗粒。,（4）当细胞内病毒颗粒多达 10,5,时，细胞破裂，释放出大量病毒颗粒。,55,3、构建SV40 克隆载体的基本策略和途径,（1）晚期取代载体,将,SV40,的晚期基因区域用合适的限制性酶切割后，即可用外源基因取代切割掉的晚期区域。,56,（2）早期取代载体,早期取代载体是通过用,Eco,RI,和,Nod,I,双酶切去掉早期基因区域，然后用外源基因代替去掉的早期基因区域而获得的。,57,（3）穿梭载体,可以认为这种克隆载体是质粒克隆载体的衍生物，由 SV40 的 DNA 片段与质粒重组而成。,优点，,如：遗传背景清楚，容易制备，拷贝数高，病毒的早期功能及晚期功能都有温度敏感突变株等。,缺陷：,SV40,重组病毒转染细胞，随着病毒的繁殖，细胞便裂解；, 容纳外源,DNA,能力较小，如构建晚期取代载体时，去掉一段晚期,DNA,后，插入的外源,DNA,不能大于,2500 bp,。, 存在安全隐患。,58,二、其它病毒载体,牛乳头瘤病毒杆状病毒，,RNA,肿瘤病毒、腺病毒，单纯疱疹病毒及痘苗病毒等,59,