抗体检测技术与类风湿因子

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,抗体检测技术,1,抗体检测技术,免疫酶技术,免疫荧光技术,凝集反应,沉淀反应,补体结合试验,放射免疫测定,蛋白印迹,免疫共沉淀,亲和力测定,2,凝集反应,凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。,3,沉淀反应,1,、絮状沉淀反应,2,、环状沉淀反应,3,、双向扩散,4,、单向免疫扩散,4,双向扩散法的操作：,生理盐水配制,1%-5%,的琼脂，取,4mL,倒在显微镜用的载玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。,5,抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉淀弧的特征不同：,抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧有多条，彼此互不干扰。,6,酶联免疫吸附测定实验,(ELISA),Enzyme linked immunosorbent assay,7,实验原理,ELISA,利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性检测抗原或抗体,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性,使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性,按一定步骤进行抗原抗体反应,加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析,8,方法类型,ELISA,既可测抗原又可测抗体，根据试剂来源、标本性状以及检测的具体条件，可设计出不同类型的检测方法：,1.,直接法,2.,间接法,3.,双抗体夹心法,4.,双夹心间接法,9,10,11,A sandwich ELISA,. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) enzyme-linked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.,12,一、试剂及仪器准备,（一） 免疫吸附剂,1.,固相载体, 要求： 吸附力强, 能保持,Ag,或,Ab,活性, 不参与化学反应,13,载体性能比较,要求,：,载体材料,+,、,-,结果差别大,检测方法,：,10ug/L IgG,包被,加酶标抗,IgG,，显色后，测,20,孔的,OD,，要求,CV10%,常用载体：,材料,：,聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等,形状,：,小试管、小珠、微量反应板,14,2. Ag,或,Ab,：,纯度高、效价高、结合力高,3.,免疫吸附剂,(,固相,Ag,或,Ab),：,包被,：,将,Ag,或,Ab,固相化的过程,包被缓冲液,封闭,：,包被后在用,1-5%,小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附的干扰,15,酶结合物：,1.,要求：,纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定,2.,常用酶,：,HRP,、,AP,、,-,半乳糖苷酶等,3.,底物：,HRP,可溶性底物及呈色：,邻苯二胺,(OPD),：橙红,(492nm),；四甲基联苯胺,(TMB),：蓝色,(450nm),5-,氨基水杨酸,(5-ASA),：棕色,(550nm),鲁咪诺,+H2O2,：荧光,HRP,不可溶性底物及呈色：,DAB,：棕黄色,-,萘酚：红色,3-,氧基,-9-,乙基卡唑：红色,4-,氯,-1-,萘酚：灰蓝色,AP,可溶性底物及呈色：,对硝基苯磷酸酯,(P-NPP),：黄色,(405nm) 4-,甲基伞基磷酸酯,(4-MuP),：荧光,AP,不可溶性底物及呈色：,NBT,和,BCIP,混合液：紫色 坚固红和萘酚,ASMX,混合液：红色,-,半乳糖苷酶：,4-,甲基伞基,-,-,半乳糖苷：荧光,16,4.,酶结合物的制备：,戊二醛交联法,过碘酸盐氧化法,17,（三）设备：,酶标比色仪,简称,酶标仪,指测读,ELISA,光度计；针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计,性能指标,：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性,优良的酶标仪的读数一般可精确,0.001,，准确性为,1%,，重复性达,0.5%,操作,：室温宜在,15-30,，使用前先预热仪器,15-30min,，测读结果更稳定。测读,A,值时，要选用产物的敏感吸收峰，如,OPD,用,492nm,波长。有的酶标仪可用双波长式测读,18,19,用途,Dr Dennis E Bidwell and Alister Voller created the ELISA test to detect various kind of diseases, such as malaria, Chagas disease, and Johnes disease. ELISA tests also are used as in in vitro diagnostics in medical laboratories. The other uses of ELISA include:,detection of Mycobacterium antibodies in tuberculosis,detection of rotavirus in feces,detection of hepatitis B markers in serum,detection of enterotoxin of E. coli in feces,20,WESTERN BLOT,步骤：,试剂准备：,1,、,SDS-PAGE,试剂,:,见电泳实验。,2,、匀浆缓冲液：,1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml,；,10%SDS 6.0ml,；,-,巯基乙醇,0.2ml,；,ddH,2,O 2.8ml,。,3,、转膜缓冲液：甘氨酸,2.9g,；,Tris 5.8g,；,SDS 0.37g,；甲醇,200ml,；加,ddH,2,O,定容至,1000ml,。,4,、,0.01M PBS(pH7.4),：,NaCl 8.0g,；,KCl 0.2g,；,Na,2,HPO4 1.44g,；,KH,2,PO4 0.24g,；加,ddH,2,O,至,1000ml,。,5,、膜染色液：考马斯亮兰,0.2g,；甲醇,80ml,；乙酸,2ml,；,ddH,2,O118 ml,。包被液（,5%,脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉,1.0g,溶于,20ml,的,0.01M PBS,中。,6,、显色液：,DAB 6.0mg,；,0.01M PBS 10.0ml,；硫酸镍胺,0.1ml,；,H,2,0,2,1.0,l,。,21,样品制备,含量测定,22,SDS,PAGE,电泳,23,转膜,24,免疫反应,25,化学发光,26,类风湿因子,类风湿因子（,rheumatoid factor,RF,）可分为,IgM,、,IgA,、,IgG,、,IgD,、,IgE,五型（注：在临床内科学中描述为四型，没有,IgD,型；但在实验室诊断学中描述为,5,型），是类风湿关节炎血清中针对,IgG FC,片段上抗原表位的一类自身抗体，类风湿因子阳性患者较多伴有关节外表现，如皮下结节及血管炎等。,27,类风湿因子,约,90%,类风湿性关节炎（,RA,）患者的,RF,呈阳性。,IgA-RF,与骨质破坏有关，早期,IgA-RF,升高常提示病情严重，预后不良；,IgE-RF,升高时，已属病情晚期。,某些自身免疫病，如冷球蛋白血症、进行性全身性硬化症、干燥综合征、,SLE,等患者都有较高的阳性率；一些其他疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出现,RF,。,28,类风湿因子,近年来对,IgM,型类风湿因子的生物作用已有所了解，这些生物作用包括：,1,、调节体内免疫反应；,2,、激活补体，加快清除微生物感染；,3,、清除免疫复合物使机体免受循环复合物的损伤。,29,类风湿因子,测定,IgG,、,IgA,、,IgM,类,RF,通常用,ELISA,间接法，即用热凝集兔,IgG,包被反应板微孔，加入检样后，再分别加抗人,IgG,、,IgA,、,IgM,酶标记抗体，使反应后再与底物呈色。为防止各,Ig,类别,RF,相互干扰，酶标记抗体使用标记的抗体,F,（,ab,）,2,片段。,30,类风湿因子,RF,因子浓度的检测对自身免疫性疾病如,类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、结缔组织病、硬皮病,等的诊断治疗和预后有重要的指导意义。另外，在慢性炎性反应性疾病中，因炎性反应对免疫系统造成的长期反复的刺激，引起免疫系统紊乱，也可导致,RF,浓度的升高，如慢性活动性肝炎患者等。,31,